Москва, Россия
Москва, Россия
Москва, Россия
Москва, Россия
Москва, Россия
Растительное сырье – доступный и перспективный субстрат для получения индивидуальных ферментов и мультиэнзимных композиций разного назначения. Эффективными продуцентами для промышленного производства ферментных препаратов могут стать термофильные бактерии, поскольку их ферменты обладают рядом преимуществ – термоустойчивостью и химической стабильностью. Актуальным является поиск термофильных штаммов, способных продуцировать промышленно ценные ферменты с высоким выходом при использовании недорогих растительных субстратов. Цель исследования – изучить состав комплекса гидролитических ферментов термофильного штамма-продуцента протеаз Bacillus subtilis Кб.12.Гл.35 при культивировании на средах с компонентами растительного происхождения и выбрать перспективное сырье для синтеза термостабильных гидролаз, в частности протеаз, амилаз и гемицеллюлаз. Объект исследования – термофильный штамм Кб.12.Гл.35, выделенный из образца компоста и идентифицированный методом секвенирования гена 16S рРНК как Bacillus subtilis. Для исследования состава комплекса гидролаз штамм выращивали на средах с растительной мукой в комбинации с дрожжевым или кукурузным экстрактом, оценивали активность внеклеточных ферментов. В качестве растительной муки в количестве 1 % использовали гороховую, льняную, нутовую, овсяную, рисовую, амарантовую, соевую, а также смесь на основе амарантовой и соевой муки. Активность протеаз определяли по казеину и на основе зимографического анализа, активность карбогидраз – методом с 3,5-динитросалициловой кислотой. При культивировании продуцента гидролаз на питательных средах с растительной мукой (1 %) и кукурузным экстрактом (0,5 %) максимальный уровень синтеза протеаз (более 400 ед/мл) выявлен при использовании амарантовой, овсяной и рисовой муки; амилаз (более 1300 ед/мл) – нутовой, овсяной и рисовой муки; галактоманнаназ (более 200 ед/мл) и ксиланаз (более 60 ед/мл) – амарантовой, гороховой и нутовой; арабиногалактаназ (более 35 ед/мл) – амарантовой, нутовой и рисовой муки. По результатам зимографического анализа можно предположить, что наибольшую роль в протеолитической активности играют ферменты массой 24,7–28,2 кДа, а также протеазы массой 62,7–75,0 кДа, т. к. их активность ярко выражена при культивировании на растительном сырье, в отличие от стандартной среды LB. Секреция протеазы массой 15,1 кДа на сырье практически не отличалась от ее уровня на стандартной среде. Термофильный штамм Кб.12.Гл.35 можно рассматривать в качестве перспективного продуцента для получения протеаз, амилаз и гемицеллюлаз при использовании в составе среды растительной муки и кукурузного экстракта. Дальнейшие исследования могут быть направлены на оптимизацию состава питательных сред и условий культивирования для повышения выхода целевой группы гидролитических ферментов.
Термофильные бактерии, Bacillus, протеазы, амилазы, растительное сырье, зимография
1. Mokrani S, Nabti EH. Recent status in production, biotechnological applications, commercial aspects, and future prospects of microbial enzymes: A comprehensive review. International Journal of Agricultural Science and Food Technology. 2024;10(1):006–020. https://doi.org/10.17352/2455-815x.000202
2. Tripathi P, Sinha S. Industrial biocatalysis: An insight into trends and future directions. Current Sustainable/Renewable Energy Reports. 2020;7:66–72. https://doi.org/10.1007/s40518-020-00150-8
3. Meghwanshi GK, Kaur N, Verma S, Dabi NK, Vashishtha A, et al. Enzymes for pharmaceutical and therapeutic applications. Biotechnology and Applied Biochemistry. 2020;67(4):586–601. https://doi.org/10.1002/bab.1919
4. Shukla P. Synthetic biology perspectives of microbial enzymes and their innovative applications. Indian Journal of Microbiology. 2019;59(4):401–409. https://doi.org/10.1007/s12088-019-00819-9
5. Singh RS, Singh T, Pandey A. Microbial enzymes–An overview. In: Singh RS, Singhania RR, Pandey A, Larroche C, editors. Advances in Enzyme Technology. MA: Elsevier; 2019. pp. 1–40. https://doi.org/10.1016/B978-0-444-64114-4.00001-7
6. Zhang Y, Geary T, Simpson BK. Genetically modified food enzymes: A review. Current Opinion in Food Science. 2019;25:14–18. https://doi.org/10.1016/j.cofs.2019.01.002
7. Burkhardt C, Baruth L, Meyer-Heydecke N, Klippel B, Margaryan A, et al. Mining thermophiles for biotechnologically relevant enzymes: Evaluating the potential of European and Caucasian hot springs. Extremophiles. 2023;28:5. https://doi.org/10.1007/s00792-023-01321-3
8. Thapa S, Li H, OHair J, Bhatti S, Chen F-C, et al. Biochemical characteristics of microbial enzymes and their significance from industrial perspectives. Molecular Biotechnology. 2019;61:579–601. https://doi.org/10.1007/s12033-019-00187-1
9. Atalah J, Cáceres-Moreno P, Espina G, Blamey JM. Thermophiles and the applications of their enzymes as new biocatalysts. Bioresource Technology. 2019;280:478–488. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.02.008
10. Kumar S, Dangi AK, Shukla P, Baishya D, Khare SK. Thermozymes: Adaptive strategies and tools for their biotechnological applications. Bioresource Technology. 2019;278:372–382. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.01.088
11. Han H, Ling Z, Khan A, Virk AK, Kulshrestha S, et al. Improvements of thermophilic enzymes: From genetic modifications to applications. Bioresource Technology. 2019;279:350–361. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.01.087
12. Ajeje SB, Hu Y, Song G, Peter SB, Afful RG, et al. Thermostable cellulases / Xylanases from thermophilic and hyperthermophilic microorganisms: Current perspective. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2021;9:794304. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.794304
13. Verma J, Sourirajan A, Dev K. Bacterial diversity in 110 thermal hot springs of Indian Himalayan Region (IHR). 3 Biotech. 2022;12:238. https://doi.org/10.1007/s13205-022-03270-8
14. Finore I, Feola A, Russo L, Cattaneo A, di Donato P, et al. Thermophilic bacteria and their thermozymes in composting processes: A review. Chemical and Biological Technologies in Agriculture. 2023;10:7. https://doi.org/10.1186/s40538-023-00381-z
15. Romanova MV, Dolbunova AN, Epishkina YuM, Evdokimova SA, Kozlovskiy MR, et al. A thermophilic L-lactic acid producer of high optical purity: Isolation and identification. Foods and Raw Materials. 2024;12(1):101–109. https://doi.org/10.21603/2308-4057-2024-1-591
16. Kambourova M. Thermostable enzymes and polysaccharides produced by thermophilic bacteria isolated from Bulgarian hot springs. Engineering in Life Sciences. 2018;18(11):758–767. https://doi.org/10.1002/elsc.201800022
17. Liang Q, Zhan Y, Yuan M, Cao L, Zhu C, et al. Improvement of the catalytic ability of a thermostable and acidophilic β-mannanase using a consensus sequence design strategy. Frontiers in Microbiology. 2021;12:722347. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.722347
18. Tan S, Tao X, Zheng P, Chen P, Yu X, et al. Thermostability modification of β-mannanase from Aspergillus niger via flexibility modification engineering. Frontiers in Microbiology. 2023;14:1119232. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1119232
19. Solanki P, Putatunda C, Kumar A, Bhatia R, Walia A. Microbial proteases: Ubiquitous enzymes with innumerable uses. 3 Biotech. 2021;11:428. https://doi.org/10.1007/s13205-021-02928-z
20. Herrera-Márquez O, Fernández-Serrano M, Pilamala M, Jácome MB, Luzón G. Stability studies of an amylase and a protease for cleaning processes in the food industry. Food and Bioproducts Processing. 2019;117:64–73 https://doi.org/10.1016/j.fbp.2019.06.015
21. Velázquez-De Lucio BS, Hernández-Domínguez E, Villa-García M, Díaz-Godínez G, Mandujano-González V, et al. Exogenous enzymes as zootechnical additives in animal feed: A review. Catalysts. 2021;11(7):851. https://doi.org/10.3390/catal11070851
22. Nagarajan DR, Krishnan C. Use of a new catabolite repression resistant promoter isolated from Bacillus subtilis KCC103 for hyper-production of recombinant enzymes. Protein Expression and Purification. 2010;70(1):122–128. https://doi.org/10.1016/j.pep.2009.09.020
23. Xiao F, Li Y, Zhang Y, Wang H, Zhang L, et al. A new CcpA binding site plays a bidirectional role in carbon catabolism in Bacillus licheniformis. iScience. 2021;24(5):102400. https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.102400
24. Sun B, Zou K, Zhao Y, Tang Y, Zhang F, et al. The fermentation optimization for alkaline protease production by Bacillus subtilis BS-QR-052. Frontiers in Microbiology. 2023;14:1301065. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1301065
25. Naik B, Kumar V, Rizwanuddin S, Chauhan M, Gupta AK, et al. Agro-industrial waste: A cost-effective and eco-friendly substrate to produce amylase. Food Production, Processing and Nutrition. 2023;5:30. https://doi.org/10.1186/s43014-023-00143-2
26. Bhange K, Chaturvedi V, Bhatt R. Simultaneous production of detergent stable keratinolytic protease, amylase and biosurfactant by Bacillus subtilis PF1 using agro industrial waste. Biotechnology Reports. 2016;10:94–104. https://doi.org/10.1016/j.btre.2016.03.007
27. Su Y, Liu C, Fang H, Zhang D. Bacillus subtilis: A universal cell factory for industry, agriculture, biomaterials and medicine. Microbial Cell Factories. 2020;19:173. https://doi.org/10.1186/s12934-020-01436-8
28. Baweja M, Tiwari R, Singh PK, Nain L, Shukla P. An alkaline protease from Bacillus pumilus MP 27: Functional analysis of its binding model toward its applications as detergent additive. Frontiers in Microbiology. – 2016;7:01195. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01195
29. Abd-Elhalim BT, Gamal RF, El-Sayed SM, Abu-Hussien SH. Optimizing alpha-amylase from Bacillus amyloliquefaciens on bread waste for effective industrial wastewater treatment and textile desizing through response surface methodology. Scientific Reports. 2023;13:19216. https://doi.org/10.1038/s41598-023-46384-6
30. Devi S, Dwivedi D, Bhatt AK. Utilization of agroresidues for the production of xylanase by Bacillus safensis XPS7 and optimization of production parameters. Fermentation. 2022;8(5):221. https://doi.org/10.3390/fermentation8050221
31. Srivastava PK, Kapoor M. Cost-effective endo-mannanase from Bacillus sp. CFR1601 and its application in generation of oligosaccharides from guar gum and as detergent additive. Preparative Biochemistry & Biotechnology. 2014;44(4):392–417. https://doi.org/10.1080/10826068.2013.833108
32. Романова М. В., Кузнецов А. Е., Белодед А. В. Молекулярно-биологическая и биохимическая характеристика внеклеточных протеаз термофильных бактериальных штаммов. Бутлеровские сообщения. 2021. Т. 68. № 12. С. 103–111. https://elibrary.ru/LBSMNK
33. de Vos P, Garrity GM, Jones D, Krieg NR, Ludwig W, et al. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition, Vol. 3. NY: Springer; 2009. pp. 21–128. https://doi.org/10.1007/978-0-387-68489-5_3
34. Tamura K, Stecher G, Kumar S. MEGA11: Molecular evolutionary genetics analysis version 11. Molecular Biology and Evolution. 2021;38(7):3022–3027. https://doi.org/10.1093/molbev/msab120
35. Oliver GW, Stetler-Stevenson WG, Kleiner DE. Zymography, casein zymography, and reverse zymography: Activity assays for proteases and their inhibitors. In: Sterchi EE, Stöcker W, editors. Proteolytic enzymes. Berlin: Springer Lab Manual; 1999. pp. 63–76. https://doi.org/10.1007/978-3-642-59816-6_5
36. Гольдштейн В., Лукин Н., Радин О. Кукурузный экстракт в кормах. Комбикорма. 2022. № 3. С. 45–46. https://doi.org/10.25741/2413-287X-2022-03-3-170
37. Harwood CR, Kikuchi Y. The ins and outs of Bacillus proteases: Activities, functions and commercial significance. FEMS Microbiology Reviews. 2022;46(1):fuab046. https://doi.org/10.1093/femsre/fuab046
38. Al-Attar H, Ahmed J, Thomas L. Rheological, pasting and textural properties of corn flour as influenced by the addition of rice and lentil flour. LWT. 2022;160:113231. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2022.113231
39. Filipović J, Ivkov M, Košutić M, Filipović V. Ratio of omega-6/omega-3 fatty acids of spelt and flaxseed pasta and consumer acceptability. Czech Journal of Food Sciences. 2016;34(6):522–529. https://doi.org/10.17221/384/2015-CJFS
40. Agume ASN, Njintang NY, Mbofung CMF. Effect of soaking and roasting on the physicochemical and pasting properties of soybean flour. Foods. 2017;6(2):12. https://doi.org/10.3390/foods6020012
41. Malik M, Sindhu R, Dhull SB, Bou-Mitri C, Singh Y, et al. Nutritional composition, functionality, and processing technologies for amaranth. Journal of Food Processing and Preservation. 2023;2023(1):1753029. https://doi.org/10.1155/2023/1753029
42. Noguchi M, Hasegawa Y, Suzuki S, Nakazawa M, Ueda M, et al. Determination of chemical structure of pea pectin by using pectinolytic enzymes. Carbohydrate Polymers. 2020;231:115738. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2019.115738
43. Karki B, Maurer D, Kim TH, Jung S. Comparison and optimization of enzymatic saccharification of soybean fibers recovered from aqueous extractions. Bioresource Technology. 2011;102(2):1228–1233. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2010.08.004
44. Hsiao H-Y, Anderson DM, Dale NM. Levels of β-mannan in soybean meal. Poultry Science. 2006;85(8):1430–1432. https://doi.org/10.1093/ps/85.8.1430
45. Ray S, Paynel F, Morvan C, Lerouge P, Driouich A, et al. Characterization of mucilage polysaccharides, arabinogalactanproteins and cell-wall hemicellulosic polysaccharides isolated from flax seed meal: A wealth of structural moieties. Carbohydrate Polymers. 2013;93(2):651–660. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2012.12.034
46. Yan F, Tian S, Chen H, Gao S, Dong X, et al. Advances in xylooligosaccharides from grain byproducts: Extraction and prebiotic effects. Grain & Oil Science and Technology. 2022;5(2):98–106. https://doi.org/10.1016/j.gaost.2022.02.002
47. Xie F, Feng F, Liu D, Quan S, Liu L, et al. Bacillus amyloliquefaciens 35M can exclusively produce and secrete proteases when cultured in soybean-meal-based medium. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2022;209(Part 2):112188. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2021.112188
48. Wu XC, Nathoo S, Pang A, Carne T, Wong S. Cloning, genetic organization, and characterization of a structural gene encoding bacillopeptidase F from Bacillus subtilis. The Journal of Biological Chemistry. 1990;265(12):6845–6850. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(19)39225-7
49. Ning Y, Yang H, Weng P, Wu Z. Analysis and identification of the extracellular proteases from Bacillus velezensis SW5. Applied Biochemistry and Microbiology. 2021;57:S27–S37 https://doi.org/10.1134/S0003683821100082
50. Yoo JY, Yao Z, Lee SJ, Jeon HS, Kim JH. Cloning and expression of a fibrinolytic enzyme gene, aprECJ1, from Bacillus velezensis CJ1 isolated from Myeolchi Jeotgal. Microbiology and Biotechnology Letters. 2021;49(3):289–297. https://doi.org/10.48022/mbl.2104.04012
