Ульяновск, Россия
Ульяновск, Россия
Ульяновск, Россия
Ульяновск, Россия
Ульяновск, Россия
Ульяновск, Россия
В работе рассмотрена сопряженность между приростом клеточной массы трансформированных P. рastoris/pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT, составом питательных сред и жизнеспособностью штаммов-продуцентов на основе источника углерода и устойчивости к зеоцину, с позиции подбора оптимальных условий для индукции белка химозина. После трансформации P. pastoris GS115/his4 и получения штамма-продуцента P. рastoris/pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT отмечена сопряженность между скоростью прироста клеточной массы и концентрациями зеоцина в среде YPD (не обогащенная глицерином и биотином) и YPD (обогащенная, биотин 0,00004 % и 1 % глицерина). Так, в частности, более динамично увеличивается плотность биомассы при культивировании на «обогащенной» среде, особенно в первые сутки, вне зависимости от концентрации зеоцина. Выявлена разнонаправленная динамика прироста клеточной массы на твердой и жидкой селективной среде. Колонии двух экспериментальных групп, выращенные на твердых селективных средах с дополнительным внесением 200 мкг/мл зеоцина, проявляли рост на третьи сутки культивирования с «обедненной» средой, и на «обогащенной» среде на третьи сутки роста не отмечено. Определена тенденция показателей оптической плотности клеточной массы, выращенной на жидкой селективной среде - после вторых суток на «обогащенной» среде скорость прироста биомассы постепенно снижается, а на «обедненной» среде наоборот, отмечается медленный прирост с увеличением интенсивности после вторых суток. Наращивание клеточной плотности штамма-продуцента P. pastoris GS115/his4 целесообразнее проводить с предварительным внесением 0,5 % метанола в качестве источника углерода и активации метаболического пути MUT (methanol utilization), фермента АОХ, так как в целом штамм GS115/his4 относится к фенотипу Mut+, который характеризуется высоким темпом роста и более высокой производительностью, следовательно, существует необходимость дополнительного внесения метанола. Таким образом полученные данные позволят в практической деятельности оптимизировать цполучение высокопродуктивного штамма-продуцента P. рastoris для дальнейшего высокого выхода рекомбинантного белка
генетическая конструкция, рекомбинантный химозин, Camelus dromedarius, дрожжи Pichia рastoris, вектор, плазмида, зеоцин, метанол, E. соli
1. Malik, A. A review on Pichia pastoris: A successful tool for expression of recombinant proteins / A. Malik [et al.] // The Pharma Innovation Journal. 2021. Vol. 10. № 11. P. 550–556.
2. Akishev, Z. Obtaining of recombinant camel chymosin and testing its milk-clotting activity on cow’s, goat’s, ewes’, camel’s and mare’s milk / Z. Akishev [et al.] // Biology. 2022. Vol. 11. № 11. 1545. https://doi.org/10.3390/biology11111545
3. Антонова, Е. И. Генетические конструкции как источник получения рекомбинантного химозина / Е. И. Антонова, А. Н. Аббязова, Н. В. Фирсова [и др.] // Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии : Сборник материалов VII Всероссийской научно-практической конференции. Чебоксары: ИД «Среда», 2024. С. 49–55. https://doi.org/10.31483/r-112097; https://www.elibrary.ru/bboeyl
4. Obst, U. A modular toolkit for generating Pichia pastoris secretion libraries / U. Obst, T. K. Lu, V. Sieber // ACS Synthetic Biology. 2017. Vol. 6. № 6. P. 1016–1025. https://doi.org/10.1021/acssynbio.6b00337
5. Akishev, Z. Constitutive expression of Camelus bactrianus prochymosin B in Pichia pastoris / Z. Akishev [et al.] // Heliyon. 2021. Vol. 7. № 5. e07137. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e07137
6. Wang, N. Expression and characterization of camel chymosin in Pichia pastoris / N. Wang, [et al.] // Protein Expression and Purification. 2015. Vol. 111. P. 75–81. https://doi.org/10.1016/j.pep.2015.03.012
7. Мурашкин, Д. Е. Анализ некоторых биохимических свойств рекомбинантного химозина сибирской косули (Capreolus pygargus), полученного в культуре клеток млекопитающих (CHO-K1) / Д. Е. Мурашкин, С. В. Беленькая, А. А. Бондарь [и др.] // Биохимия. 2023. Т. 88. №. 9. С. 1556–1569. https://doi.org/10.31857/ S0320972523090087; https://www.elibrary.ru/wwnnwk
8. Беленькая, С. В. Разработка продуцента рекомбинантного химозина марала на основе дрожжей Kluyveromyces lactis / С. В. Беленькая, В. В. Ельчанинов, Д. Н. Щербаков // Биотехнология. 2021. Т. 37. № 5. С. 20–27. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2021-37-5-20-27; https://www.elibrary.ru/qzyxec
9. Patra, P. Recent advances in systems and synthetic biology approaches for developing novel cell-factories in non-conventional yeasts / P. Patra [et al.] // Biotechnology Advances. 2021. № 47. 107695. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107695
10. Küberl, A. High-quality genome sequence of Pichia pastoris CBS7435 / A. Küberl [et al.] // Journal of Biotechnology. 2011. Vol. 154. № 4. P. 312–320. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2011.04.014
11. Cereghino, G. P. Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris / G. P. Cereghino [et al.] // Current Opinion in Biotechnology. 2002. № 13. P. 329–332. https://doi.org/10.1016/s0958-1669(02)00330-0
12. Inan, M. Non-repressing carbon sources for alcohol oxidase (AOX1) promoter of Pichia pastoris / M. Inan, M. M. Meagher // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2001. Vol. 92. № 6. P. 585–589. https://doi.org/10.1263/jbb.92.585
13. Sunga, A. J. Posttransformational vector amplification in the yeast Pichia pastoris / A. J. Sunga, I. Tolstorukov, J. M. Cregg // FEMS Yeast Research. 2008. Vol. 8. № 6. P. 870–876. https://doi.org/10.1111/j.1567-1364.2008.00410.x
14. Saitua, F. Dynamic genome-scale metabolic modeling of the yeast Pichia pastoris / F. Saitua [et al.] // BMC systems biology. 2017. Vol. 11. 27. https://doi.org/10.1186/s12918-017-0408-2
15. Jungo, C. Mixed feeds of glycerol and methanol can improve the performance of Pichia pastoris cultures: A quantitative study based on concentration gradients in transient continuous cultures / C. Jungo, I. Marison, U. Von Stockar // Journal of Biotechnology. 2007. Vol. 128. № 4. P. 824–837. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2006.12.024
16. de Lima, P. B. Novel homologous lactate transporter improves l-lactic acid production from glycerol in recombinant strains of Pichia pastoris / P. B. A. de Lima [et al.] // Microbial Cell Factories. 2016. № 15. 158. https://doi.org/10.1186/s12934-016-0557-9
