Введение
В настоящее время не теряет актуальности вопрос о снижении риска распространения различных инфекций через продукты питания. Повышение биобезопасности продуктов питания и по сей день остается сложной задачей, одним из путей решения которой является создание в продуктах конкурентной микробиологической среды, препятствующей развитию болезнетворной и гнилостной микрофлоры. Вносимая в продукт полезная микрофлора способна не только снизить риск развития патогенных и гнилостных микроорганизмов, но и привнести функциональные характеристики [1–4].
Одной из важнейших групп симбионтной микрофлоры человека является род Bifidobacterium. Впервые бифидобактерии были выделены и охарактеризованы в 1900 г. учеником И.И. Мечникова, французским ученым Henry Tissier. Бифидобактерии были описаны как ветвеобразные, как правило, не образующие газ анаэробные микроорганизмы с бифуркациями на концах, присутствующие в фецес грудных детей. Изначально микроорганизм получил обозначение Bacillus bifidus и был отнесен к роду Lactobacillus, но в 1960 г. был отнесен в самостоятельный род Bifidobacterium [2, 3, 5].
Представители рода Bifidobacterium являются естественными обитателям толстого кишечника детей и взрослых людей, при этом множество видов обладает немалым количеством позитивных эффектов на организм хозяина [5]. Бифидобактерии, постоянно присутствующие в желудочно-кишечном тракте и на лизистых человека и животных, принимают участие в морфогенезе и функциях различных систем организма-хозяина – пищеварительной, иммунной, сердечно-сосудистой, эндокринной и др. Это происходит за счет участия бифидобактерий в обмене белков, липидов, углеводов, а также благодаря большому количеству продуцируемых биологически активных веществ: ферментов, экстрацеллюлярных белков, полисахаридов [2, 3, 4]. Антагонистическая активность бифидобактерий связана с продукцией органических кислот (ацетата и лактата), бактериоцинов, а также с блокированием сайтов адгезии на слизистой кишечника, что предотвращает фиксацию на них потенциально патогенных микроорганизмов и обусловливает важнейшую роль бифидобактерий в колонизационной резистентности [2, 4, 5].
Благодаря продуктам антагонистической активности в отношении патогенной и гнилостной микрофлоры бифидобактерии представляют собой значительный интерес как защитный агент продуктов питания [1, 3, 5]. Особенно важна антагонистическая активность штаммов бифидобактерий в отношении Staph. аureus, E. Coli, Salmonella, Bacillus cereus, Pseudomonas, Yersinia, Listeria, поскольку эти микроорганизмы даже в малых количествах в пищевых продуктах представляют значительную угрозу безопасности пищи, а значит, и здоровью населения [3, 5].
В данной работе описывается ряд исследований, направленных на получение ценного штамма бифидобактерий и изучение его биологических и технологических характеристик.
Условия эксперимента
Используемый в исследовании штамм Bifido-bacterium bifidum GG-72 (ВКПМ-АС-1884) был выделен из фецес здорового человека и хранится в коллекции промышленных штаммов микроорганизмов кафедры «Технология молока и молочных продуктов» ГОУ ВПО МГУПП, а также во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика.
Объектом сравнения биологических и технологических свойств служили новый неидентифицированный штамм Bifidobacterium 771 и Bifidobacterium adolescentis BGV-11 (ВКПМ-АС-1742). Штамм BGV-11 обладает выраженными антагонистическими свойствами против широкого спектра патогенных и гнилостных микроорганизмов, успешно прошел полный цикл клинических испытаний и рекомендован для использования в пищевой и фармацевтической промышленности [6].
Очистка от посторонней микрофлоры. Очистку проводили рассеиванием исследуемого материала на селективные питательные среды с добавлением антибиотика диклоксацилина (Sigma-Aldrich, Германия) [3].
Условия культивирования. Штамм GG-72 культивировали анаэробно при (37,5±1) °С на поверхности плотной питательной среды или в высоком столбике полужидкой питательной среды. Были использованы следующие питательные среды: MRS-агар (HiMedia, Индия) c добавлением 0,05 % L-цистеин-гидрохлорида (Serva, Германия); полужидкая тиогликолевая питательная среда (Центр прикладной микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск), ГМК-1, ГМК-2 (БиоКомпас-С, г. Углич). Анаэробные условия создавали с помощью анаэростата AnaeroPack (Mitsubishi Gas Chemical Company, Япония), газогенераторов GENbox anaer (bioMérieux, Франция). Наличие анаэробных условий контролировали индикаторами анаэробности (Oxoid, Англия) [3, 7, 8].
Перед каждым экспериментом готовили свежую 17-часовую культуру не менее 3-й генерации. При этом в стерильную питательную среду засевали 0,1 % культуры бифидобактерий предыдущей генерации.
Генетическая идентификация. При генетической идентификации проводили рассев культуры до отдельной колонии и получали биомассу для анализа 16S рРНК. Выделение ДНК, подбор праймеров и режимов ПЦР осуществляли по соответствующим методикам [8–10]. Консервативные праймеры для наработки гена, кодирующего 16S рРНК: 8f – aga gtt tga tcc tgg ctc ag; 926r – ccg tca att cct ttr agt tt; 1492r – ggt tac cct tgt tac gac tt. Режимы реакции: 1 – 95 °С – 3 мин; 2 – 35 циклов: а) 95 °С – 30 с; б) 57 °С – 30 с; в) 72 °С – 1 мин 30 с; г) 72 °С – 5 мин.
Секвенирование последовательности гена, кодирующего 16S рРНК, проведено на автоматическом секвенаторе АЕ3000. Далее полученные секвенсы сравнивали и строили деревья родства. Для анализа секвенсов и построения филогенетических деревьев родства были использованы базы данных GenBank и Ribosomal Database Project-II (RDP-II) [12].
Стабильность воспроизведения результатов обеспечена проведением не менее трех повторностей ПЦР.
Условия электрофореза продуктов ПЦР исследуемых образцов были следующими: 1,0 % агарозный гель, электрофорез при напряженности электрического поля 5 В/см [9].
Видовая идентификация штамма проведена на базе ФГУП ГосНИИгенетика – ВКПМ, г. Москва.
Подтверждение безопасности. Штамм GG-72 проверяли на безвредность и нетоксичность. Исследование проводили на лабораторной линии стерильных белых мышей.
Изучение динамики роста. Динамика роста штамма GG-72 была изучена в промежутке от 0 до 24 часов. Исследования вели в сравнении с референс-штаммом BGV-11 (ВКПМ-АС-1742). В ходе эксперимента оценивали изменение количества клеток, оптической плотности и кислотности культуральной жидкости.
Оптическую плотность измеряли на фотометре КФК-3-01-ЗОМЗ, кислотность измеряли с помощью рН-метра рН-150МИ с электродом ЭСК-10605/7.
Экспериментальные образцы готовили через ряд последовательных десятикратных разведений, добиваясь в результате количества клеток близкого к lg 5 КОЕ/см3. Количество клеток подтверждали микробиологическими посевами образцов инокулята и культуры в 0 часов роста на плотные питательные среды.
Результаты исследования динамики роста учитывали через 72 часа культивирования при (37,5±1) °С; исследование изменений кислотности культуральной жидкости вели непосредственно в ходе эксперимента.
Антагонистическая активность. Антагонистическую активность бифидобактерий определяли методом развивающихся смешанных популяций в сравнении с ростом патогенных тест-культур в монокультуре. В качестве представителей патогенных микроорганизмов использовали штаммы E. coli O157 и Staph. aureus 209-P, полученные из коллекции ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича». Оценку антагонистических свойств проводили в сравнении со штаммами бифидобактерий BGV-11 и 771. Культуры тест-микроорганизмов готовили на скошенном мясо-пептонном агаре. Совместное культивирование проводили на тиогликолевой питательной среде (Центр прикладной микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск).
Эксперимент проводили по соответствующим методикам, описанным в литературе [1, 3, 8, 13].
Исследование с патогенными микроорганизмами проводили на базе испытательного центра «Биотест» при ГОУ ВПО МГУПБ.
Определение технологических свойств и показателей, косвенно характеризующих выживаемость в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). Эксперимент со штаммом GG-72 по оценке технологических свойств и выживаемости в ЖКТ проводили путем культивирования в высоком столбике тиогликолевой питательной среды, которая для создания специфических условий роста бифидобактерий была модифицирована путем внесения специфических добавок для создания следующих характеристик:
– NaCl: 2 %, 4 %, 6,5 %;
– фенол: 0,4 %;
– желчь: 20 %, 40 %;
– рН: 5,5; 7,2; 8,3.
Была использована желчь крупного рогатого скота. Значение рН питательной среды устанавливали с помощью стерильных растворов соляной кислоты и гидроксида натрия. После внесения добавок среды стерилизовали. После стерилизации рН среды дополнительно контролировали.
Модифицированные питательные среды засевали культурой в объемном соотношении 6 %, ресуспендировали, исключая дополнительную аэрацию. Опытные и контрольный образцы инкубировали при температуре (37,5±1) °С в течение (36±1) ч.
Рост и развитие штамма GG-72 при разных условиях культивирования оценивали визуально в сравнении с контрольными культурами [1].
Результаты и их обсуждение
Новый штамм Bifidobacterium bifidum GG-72 был выделен из фецес здорового человека, поэтому он изначально носит природный характер и имеет основание к обладанию статусом GRAS (Generally recognized as safe) в рамках рода Bifidobacterium.
Произведена очистка штамма от посторонней микрофлоры с применением антибиотика диклоксациллина, а также первичная идентификация по фенотипическим
культурально-морфологическим признакам.
Полученный штамм Bifidobacterium bifidum GG-72 обладает основными характерными для своего рода культурально-морфологическими и тинкториальными характеристиками (рис. 1).
|
|
|
|
Рис. 1. Колонии штамма GG-72 в полужидкой питательной среде. Клетки штамма GG-72 |
|
Полученные данные позволяют заключить, что штамм GG-72 обладает типичными для рода Bifidobacterium признаками и представляет собой грамположительные клетки с бифуркациями, располагающиеся одиночно или в группах, клеточная стенка с неравномерными утолщениями. На поверхности плотной питательной среды образует мелкие и точечные колонии (1 мм и менее 1 мм) молочного цвета полужидкой, слегка тянущейся консистенции с характерным уксусно-кисломолочным запахом.
Штамм GG-72 способен давать рост на типичных для рода Bifidobacterium питательных средах: тиогликолевая, ГМК-1, ГМК-2, МРС с добавлением 0,05 % L-цистеингидрохлорида.
Генетическая идентификация. Проведена амплификация последовательности гена, кодирующего 16S рРНК с помощью консервативных праймеров в
ходе ПЦР. Вариабельные участки гена 16S рРНК секвенированы, получена их нуклеотидная последовательность.
Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: домен Bacteria; отдел Firmicutes; тип Actinobacteria; класс Actinobacteria; подкласс Actinobacteridae; порядок Bifidobacteriales; семейство Bifidobacteriaceae; род Bifidobacterium. Установлено, что гомология с видом рода Bifidobacterium bifidum cоставляет 98 %.
Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы, находящейся на сайте RDB II (Ribosomal Database Project II), предназначенной для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев, представлены на рис. 2 в графическом виде. Идентифицируемый штамм обозначен как «uknown» [11, 12].
Рис. 2. Филогенетическое древо штамма GG-72 (обозначен как «uknown»)
с гомологичными штаммами бифидобактерий
Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97 %. По данному критерию исследуемый штамм можно отнести к виду Bifidobacterium bifidum. Отнесение штамма GG-72 к виду B. bifidum носит позитивный характер. Это обосновано принадлежностью вида к неофициальной группе бифидобактерий истинно «человеческого» происхождения и содержания этого вида до 51,9 % от общего объема микрофлоры ЖКТ у детей на грудном вскармливании [2, 14]. Вид B. bifidum способен при определенных условиях развиваться в молочном сырье, что позволяет его рекомендовать для применения в технологии молочных продуктов [2, 3, 15]. Эти факты усиливают нашу уверенность в выборе штамма для применения с позиции функционального компонента.
Подтверждение непатогенности. Проверка на отсутствие патогенных свойств GG-72 проведена на лабораторных стерильных белых мышах, которым вводили культуру GG-72. На протяжении стандартного периода времени испытаний не было выявлено никаких изменений как в поведении, так и в структуре внутренних органов мышей.
По результатам оценки динамики роста и изменения рН среды были построены графики, представленные на рис. 3 и 4.
|
|
|
|
Рис. 3. Динамика изменения количества клеток GG-72, BGV-11 |
Рис. 4. Динамика изменения активной кислотности среды культивирования |
Анализ полученных результатов показал, что штамм GG-72 способен активно накапливать биомассу. Менее чем за 12 часов роста количество клеток штамма достигало порядка lg 9 КОЕ/см3, что превышает нормируемые количества бифидобактерий lg 6 КОЕ/см3 в функциональных кисломолочных продуктах.
По изменению кислотности среды (рис. 4) можно говорить, что штамм GG-72 обладает типичной для бифидобактерий динамикой понижения кислотности среды.
Количество клеток бифидобактерий в среде на уровне lg 9 КОЕ/см3 и понижение pH среды ниже 5 ед. способно обеспечить повышение безопасности продуктов питания. Полученные данные динамики роста расширяют понимание процесса культивирования изучаемого штамма бифидобактерий. Такая информация ценна для более качественного наращивания биомассы изучаемого штамма как в лабораторных, так и в промышленных масштабах.
Антагонистическая активность. Результаты исследований, представленные на рис. 5, свидетельствуют о проявлении выраженной антагонистической активности изученных штаммов по отношению к тест-культуре E. coli O157. Следует отметить, что новый штамм Bifidobacterium bifidum GG-72 обладает таким же выраженным действием на E. coli O157, как и штамм Bifidobacterium adolescentis BGV-11, эффективность которого подтверждена клиническими испытаниями на животных и людях.
Результаты совместного культивирования патогенной тест-культуры Staph. aureus 209-P с моноштаммами бифидобактерий GG-72, 771, BGV-11 представлены на рис. 6. В данном случае можно говорить о более выраженной антагонистической активности штамма GG-72: наблюдали снижение количества Staph. aureus 209-P более чем на 4 порядка, в то время как штаммы 771, BGV-11 снижали количество патогенного тест-микроорганизма более чем на 3 порядка.
|
|
|
|
Рис. 5. Снижение роста E. coli O157 штаммами GG-72, 771, BGV-11 |
Рис. 6. Снижение роста Staph. aureus 209-P штаммами GG-72, 771, BGV-11 |
Таким образом, анализ результатов выполненных исследований показал, что новый штамм Bifido-bacterium bifidum GG-72 обладает антагонистической активностью по отношению к патогенным тест-культурам E. coli O157 и Staph. aureus 209-P, а следовательно, способен проявлять функциональные свойства.
Определение технологических свойств и показателей, косвенно характеризующих выживаемость клеток изучаемого штамма в желудочно-кишечном тракте. Результаты оценки технологических свойств штамма GG-72 представлены в табл. 1.
Таблица 1
Рост штамма GG-72
в различных технологических условиях
|
Условия
Штамм |
NaCl, % |
Фе-нол, % |
Желчь, % |
рН |
|||||
|
2 |
4 |
6,5 |
0,4 |
20 |
40 |
5,5 |
7,2 |
8,3 |
|
|
GG-72 |
+ |
– |
– |
± |
± |
– |
+ |
+ |
+ |
|
771 |
± |
– |
– |
± |
± |
– |
± |
+ |
+ |
|
BGV-11 |
+ |
± |
– |
± |
± |
± |
± |
+ |
+ |
Анализ полученных данных показал, что штамм GG-72 хорошо выдерживает изменение рН среды от 5,5 до 8,3 единиц; устойчив в питательной среде с добавлением поваренной соли в концентрации 2 %;
некоторые клетки популяции штамма способны выживать в питательной среде с добавлением 0,4 % фенола и 20 % желчи. Результаты исследований нового штамма Bifidobacterium bifidum GG-72 позволяют сделать заключение о проявлении штаммом достаточно высокой способности к действию неблагоприятных факторов, которые возникают в желудочно-кишечном тракте организма человека.
Выводы
1. Получен и идентифицирован новый штамм Bifidobacterium bifidum GG-72.
2. Штамм GG-72 можно характеризовать как природный, безопасный, проявляющий антагонисти-ческую активность по отношению к патогенным микроорганизмам.
3. Экспериментально показана косвенная способ-ность штамма GG-72 выживать в условиях желудочно-кишечного тракта человека.
4. Bifidobacterium bifidum GG-72 принят на национальное патентное депонирование во Всерос-сийскую коллекцию промышленных микроорга-низмов с присвоением номера АС-1884.
5. Сходство показателей штамма GG-72 cо штаммом BGV-11 дает предпосылки к рассмотрению нового штамма GG-72 в качестве перспективного биологического агента, способного повышать биобезопасность продуктов питания и привносить иные ценные пробиотические свойства в продукты питания.
