DEVELOPMENT OF NUTRIENT MEDIUM AND CULTIVATION REGIMES OF LACTOBACILLUS REUTERI FOR BACTERIAL CONCENTRATE PRODUCTION
Rubrics: FOOD PRODUCTION TECHNOLOGY
Authors:
1.
All-Russia Dairy Research Institute
2.
All-Russia Dairy Research Institute
3.
All-Russia Dairy Research Institute
4.
All-Russia Dairy Research Institute
Type:
Article
Pages:
from 56
to 62
Status:
Published
Received:
20.09.2016
Accepted:
20.09.2016
Published:
20.09.2016
Subject area:
UDK 637.14
UDK 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
UDK 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
Language:
Russian
Keywords:
Probiotic strains, Lactobacillus reuteri, ferments, Alcalase, Neutrase, Protamez, protosubtilin, cultivation, bacterial concentrate
Abstract (English):
Lactobacillus reuteri has been selected in the All-Russia Dairy Research Institute. The mentioned type of lactic acid bacteria possesses a wide spectrum of functional properties thus the development of L.reuteri bacterial concentrate is actual and demanded. The aim of the present investigations is to choose ferment preparation which makes it possible to obtain protein hydrolysates from skimmed milk and whey as the basis for the creation of nutrient medium, to study the impact of some factors (proteolytic ferment dose, hydrolyze duration), to carry out optimization of nutrient medium by different components, and to select the technological regimes (temperature, medium pH, inoculate dose) of L.reuteri cultivation. Four proteolytic ferments (protosubtilin, Alcalase, Neutrase, Protamex) were chosen in the concentration of 0.4% and 3.0%. The hydrolyze process duration was 1.5 and 3 h, the process temperature was 55°C, the active acidity was 7.2 pH units. Investigations on optimization of nutrient medium composition relating to separate components influence (hydrolysate, yeast extract, sucrose, cystein, inulin) on its nutritional value have been conducted. The influence of technological regimes of L.reuteri cultivation (active acidity 5.6-6,6 pH units, cultivation temperature (32-41)°C, inoculate dose from 3% to 8%) on cells accumulation in the medium has been studied. The analyses of the findings showed that the number of cells cultivated on hydrolysate obtained from skimmed milk was higher than that cultivated on hydrolysate obtained from whey. The investigation on the introduced ferment type and dose impact showed that the studied ferments possessed practically similar influence on L.reuteri cells accumulation. The intensity of cells growth became higher with the ferment dose increasing. The optimum nutrient medium composition for L.reuteri cultivation has been determined: hydrolysate - 96.75%, yeast extract - 3% and inulin - 0.25%. The optimum technological regimes for L.reuteri cultivation have been also defined: temperature - 37°C, active acidity - 6.2 pH units, inoculate dose - 6-7%, cultivation period - 6-8 hrs. In this case, the number of cells amounted to 2 x 109 CFU/cm3.
Lactobacillus reuteri has been selected in the All-Russia Dairy Research Institute. The mentioned type of lactic acid bacteria possesses a wide spectrum of functional properties thus the development of L.reuteri bacterial concentrate is actual and demanded. The aim of the present investigations is to choose ferment preparation which makes it possible to obtain protein hydrolysates from skimmed milk and whey as the basis for the creation of nutrient medium, to study the impact of some factors (proteolytic ferment dose, hydrolyze duration), to carry out optimization of nutrient medium by different components, and to select the technological regimes (temperature, medium pH, inoculate dose) of L.reuteri cultivation. Four proteolytic ferments (protosubtilin, Alcalase, Neutrase, Protamex) were chosen in the concentration of 0.4% and 3.0%. The hydrolyze process duration was 1.5 and 3 h, the process temperature was 55°C, the active acidity was 7.2 pH units. Investigations on optimization of nutrient medium composition relating to separate components influence (hydrolysate, yeast extract, sucrose, cystein, inulin) on its nutritional value have been conducted. The influence of technological regimes of L.reuteri cultivation (active acidity 5.6-6,6 pH units, cultivation temperature (32-41)°C, inoculate dose from 3% to 8%) on cells accumulation in the medium has been studied. The analyses of the findings showed that the number of cells cultivated on hydrolysate obtained from skimmed milk was higher than that cultivated on hydrolysate obtained from whey. The investigation on the introduced ferment type and dose impact showed that the studied ferments possessed practically similar influence on L.reuteri cells accumulation. The intensity of cells growth became higher with the ferment dose increasing. The optimum nutrient medium composition for L.reuteri cultivation has been determined: hydrolysate - 96.75%, yeast extract - 3% and inulin - 0.25%. The optimum technological regimes for L.reuteri cultivation have been also defined: temperature - 37°C, active acidity - 6.2 pH units, inoculate dose - 6-7%, cultivation period - 6-8 hrs. In this case, the number of cells amounted to 2 x 109 CFU/cm3.
Keywords:
Probiotic strains, Lactobacillus reuteri, ferments, Alcalase, Neutrase, Protamez, protosubtilin, cultivation, bacterial concentrate
Probiotic strains, Lactobacillus reuteri, ferments, Alcalase, Neutrase, Protamez, protosubtilin, cultivation, bacterial concentrate
Введение В последние годы наблюдается большой интерес к кисломолочным продуктам, содержащим микроорганизмы - пробиотики (бифидобактерии, ацидофильные молочнокислые палочки, L. rhamnosus, L. casei, пропионовокислые бактерии и др.), которые являются представителями нормальной кишечной микрофлоры человека. В настоящее время большое внимание уделяется изучению свойств пробиотического микроорганизма Lactobacillus reuteri. Исследования последних десятилетий выявили способность молочнокислых бактерий образовывать антимикробные вещества различной природы, которые могут стать альтернативой существующим антибиотикам и консервантам. Наиболее изученной из них является группа антибактериальных пептидов - бактериоцинов, разнообразных по уровню активности, спектру и механизму действия [1]. Бактериоцины легко расщепляются ферментами пищеварительного тракта, и поэтому они могут заменить традиционные химические [2, 3, 4]. Lactobacillus reuteri обитает в кишечнике человека и животных, продуцирует бактериоцин реутерин, который ингибирует кишечные патогены и стимулирует иммунную систему человека. Lactobacillus reuteri облигатная гетероферментативная молочнокислая палочка, микроаэрофил. Lactobacillus reuteri продуцируют большое количество глюканов и фруктанов и других экзополисахаридов, которые рассматриваются как пребиотики. Так как данный вид лактобактерий обладает широким спектром функциональных свойств, разработка импортозамещающей биотехнологии бактериального концентрата Lactobacillus reuteri, предназначенного для производства продуктов и препаратов с пробиотическими свойствами, на сегодняшний день является актуальной и востребованной. Процесс получения бактериального концентрата включает в себя наращивание клеток молочнокислых бактерий в питательной среде и их отделение центрифугированием. При этом необходимо накопить в среде максимально возможное количество активных клеток. В качестве азотистой основы для питательных сред широко используются гидролизаты белков молока. Степень гидролиза белковых субстратов и пептидный состав гидролизата зависят от многих факторов, таких как: вид и специфичность фермента, концентрация фермента и продолжительность ферментации, рН и температура ферментации и т.д. Целью настоящих исследований является выбор наиболее эффективного ферментного препарата, позволяющего получить гидролизаты белков из обезжиренного молока и сыворотки как основы для создания питательной среды, а также изучить влияние некоторых факторов (доза протеолитического фермента, продолжительность гидролиза), провести оптимизацию питательной среды различными компонентами и подобрать технологические режимы (температура, рН среды, доза инокулята клеток) культивирования L. reuteri для разработки бактериального концентрата. Объекты и методы исследований Объектом исследования является штамм Lactobacillus reuteri, выделенный в 2014 году в Центральной лаборатории микробиологии ФГБНУ «ВНИМИ». Штамм Lactobacillus reuteri хранили в замороженном состоянии при температуре минус 80 °С в растворе, содержащем 6 % обезжиренного сухого молока и 10 % глицерина. Для восстановления культуры использовали среду MRS, температуру культивирования 37 °С и анаэробные условия. Для исследований были выбраны 4 протеолитических фермента (протосубтилин, Alcalase, Neutrase, Protamex). Работы по подбору питательной среды для культивирования L. reuteri проводили поэтапно: на первом - осуществляли гидролиз обезжиренного молока и сыворотки. Исходя из литературных источников и предшествующих исследований [5, 6, 7] для эксперимента были выбраны две концентрации ферментов: 0,4 и 3 %, продолжительность гидролиза составила 1,5 и 3 ч. Согласно рекомендациям производителей температура и активная кислотность процесса составляли 55 °С и 7,2 ед. рН соответственно. Полученные гидролизаты были исследованы как питательные среды для накопления максимального количества клеток L. reuteri. Процесс культивирования проводили при температуре 37 °С в течение 16-17 ч, доза инокулята составляла 5 %. После 17 ч культивирования определяли количество клеток (чашечным методом на среде MRS в анаэробных условиях). При разработке состава питательной среды для наращивания биомассы L. reuteri использовались следующие компоненты: гидролизованное молоко, дрожжевой экстракт, инулин, сахароза и цистеин. Все полученные данные обрабатывались в программе Statistica 6.1 [8, 9]. Известно, что оптимальная температура роста и рН питательной среды для молочнокислых палочек составляет 37-41 °С и рН = 5,4-6,4 ед. рН, тогда как из литературных источников, посвященных различным исследованиям с Lactobacillus reuteri, авторы используют следующие значения температур и активной кислотности для культивирования микроорганизма: 38 °С и рН - 6,2 ед. рН, 37 °С и рН - 6,5 ед. рН, рН - 6,0-6,8 ед. рН, рН - 5,8 ед. рН и 37 °С [10]. Исходя из вышеизложенного в работе по подбору режимов культивирования микроорганизма Lactobacillus reuteri был взят следующий интервал значений активной кислотности рН: 5,6; 5,8; 6,0; 6,2; 6,4; 6,6 ед. рН и температуры 32, 35, 37, 39, 41 °С. Культивирование Lactobacillus reuteri проводили в ферментерах фирмы Das Gip (Германия) на 400 мл, а затем в ферментере Prelude фирмы Biolafitt на 5 л (Франция) при постоянных значениях активной кислотности или температурах и непрерывном раскислении водным раствором NaOH с массовой долей 30 %. Инокулят готовили на среде MRS и вносили в количестве 5 % во всех опытах. Через каждые 2 ч культивирования проводили отбор проб и определяли количество клеток Lactobacillus reuteri. Количество клеток Lactobacillus reuteri определяли методом предельных разведений в среде ГМК-1 в анаэробных условиях и термостатировании в течение 3-5 дней при температуре 37 °С в соответствии с Методическими рекомендациями по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях цельномолочной и молочно-консервной промышленности [11]. Результаты и их обсуждение Математическая обработка данных экспериментов по влиянию вида ферментов и режимов гидролиза показала, что такие факторы, как «вид среды», «вид фермента» и «доза фермента», оказывали значимый эффект на развитие клеток L. reuteri. Было установлено, что наибольшее количество клеток было получено на гидролизате, приготовленном на обезжиренном молоке - 8,8×107 КОЕ/см3, тогда как на гидролизованной сыворотке - 9,1×106 КОЕ/см3. На рис. 1 представлены данные по влиянию вида фермента на накопление клеток L. reuteri. . Рисунок1 Рис. 1. Влияние вида фермента на накопление клеток L. reuteri в гидролизованном обезжиренном молоке Так, на гидролизате, полученном с использованием фермента Alcalase при культивировании в течение 16-17 ч, количество клеток составило 6,6×107 КОЕ/см3, тогда как для фермента Neutrase оно составляло 4,9×107 КОЕ/см3 и протосубтилина - 4,7×107 КОЕ/см3, Protamex - 2,5 ×107 КОЕ/см3. Исследования показали, что при повышении дозы фермента с 0,4 до 3 % интенсивность развития клеток возрастала. Также определено, что продолжительность гидролиза среды от 1,5 до 3 ч различными ферментами не влияла на питательную ценность получаемых сред, не давая различий в количестве клеток L. reuteri. Таким образом, на основании полученных данных в дальнейших исследованиях для получения гидролизованного обезжиренного молока был выбран протеолитический фермент Alcalase с дозой внесения 3 %. С целью оптимизации состава питательной среды был разработан 5-факторный центральный композиционный план со следующим диапазоном варьирования ингредиентов: гидролизованное молоко 30-100 %, дрожжевой экстракт 0-5 %, сахароза 0-5 %, инулин 0-1 г/дм3. Проведенные исследования показали, что добавление сахарозы угнетает рост клеток L. reuteri. На рис. 2 и 3 представлены поверхности отклика влияния содержания сахарозы (без добавления и при 5 %) на количество клеток в питательной среде. Рисунок2 Рис. 2. Зависимость количества клеток L. reuteri от концентрации компонентов в среде при «Сахароза» - 0 % Рисунок3 Рис. 3. Зависимость количества клеток L. reuteri от концентрации компонентов в среде при «Сахароза» - 5 % Проведенные исследования показали, что наибольшее накопление клеток L. reuteri было получено на питательной среде без добавления сахарозы. На развитие и рост клеток в процессе культивирования влияло взаимодействие факторов «Гидролизат - Инулин» и «Дрожжевой экстракт - Цистеин». Было установлено, что с увеличением содержания инулина в составе питательной среды количество клеток возрастало. Тогда как ингредиенты дрожжевой экстракт и цистеин в составе питательной среды могут быть взаимозаменяемы (рис. 4 и 5). Рисунок4 Рис. 4. Зависимость количества клеток L. reuteri от концентрации цистеина и дрожжевого экстракта в среде Рисунок6 Рис. 5. Зависимость количества клеток L. reuteri от концентрации инулина и гидролизата в питательной среде Таким образом, было установлено, что добавление инулина, дрожжевого экстракта или цистеина в гидролизованное молоко стимулирует развитие L. reuteri, тогда как сахароза подавляет. Поэтому в дальнейших исследованиях была проведена оптимизация состава питательной среды из следующих компонентов: гидролизованное молоко, инулин, дрожжевой экстракт или цистеин. Было исследовано влияние количества вносимого дрожжевого экстракта от 0 до 5 %, инулина от 0 до 1 % и гидролизованного молока от 30 до 100 %. Наибольшее количество клеток Lactobacillus reuteri было получено с использованием разработанного состава питательной среды, содержащей гидролизованное ферментом Alcalase молоко - 96,75 %, дрожжевой экстракт - 3 %, инулин - 0,25 %. Проведены исследования по влиянию размножения Lactobacillus reuteri при культивировании при различных значениях активной кислотности (5,8; 6,0; 6,2 ед. pH) и температурах (32; 35; 37; 39; 41 °С). Доза вносимого инокулята составляла 5 %. На рис. 6 представлены данные по изменению роста L. reuteri при поддержании активной кислотности среды на уровне 5,8 ед. рН при различных температурах культивирования: 32, 35, 37, 39 и 41 °С. Анализ представленных данных показывает, что наибольшее содержание клеток было получено при культивировании при температуре 35, 37 °С и достигало 1,4×109 КОЕ/см3 и 1,5×109 КОЕ/см3 соответственно. Рис. 6. Изменение содержания клеток L. reuteri в процессе культивирования при различных температурах при рН = 5,8 ед. рН Рис. 7. Изменение содержания клеток L. reuteri в процессе культивирования при различных температурах при рН = 6,0 ед. рН На рис. 7 представлены данные по изменению роста L. reuteri при поддержании активной кислотности среды на уровне 6,0 ед. рН при различных температурах культивирования: 32, 35, 37, 39 и 41 °С. Наибольшее количество клеток (1,6×109 и 2,4×109 КОЕ/см3) было отмечено при культивировании при температуре 35 и 37 °С. На рис. 8 представлены данные по изменению роста L. reuteri при поддержании активной кислотности среды на уровне 6,2 ед. рН при различных температурах культивирования: 32, 35, 37, 39 и 41 °С. Рис. 8. Изменение содержания клеток L. reuteri в процессе культивирования при различных температурах при рН = 6,2 ед. рН 1 Рис. 9. Изменение содержания клеток при культивировании при различных значениях активной кислотности Исходя из данных, представленных на рис. 8, видно, что при температуре 35, 37 °С и активной кислотности рН = 6,2 ед. рН также отмечалось высокое количество клеток в культуральной среде. Как видно из рис. 9, интенсивное накопление клеток происходило в течение 8-10 ч (при внесении 5 % инокулята) и разница в количестве клеток в стационарной фазе роста при культивировании при разных значениях активной кислотности была невелика, варьировалась в интервале 7,5×108-1,75×109 КОЕ/см3. Однако наибольшее количество клеток было достигнуто при культивировании при более низких значениях активной кислотности в интервале рН от 5,8 до 6,2 ед. рН. Так, при активной кислотности среды 5,8 ед. рН наибольшее количество клеток составило 1,5×109 КОЕ/см3, при 6,0 ед. рН - 1,75×109 КОЕ/см3 и при 6,2 ед. рН - 1,4×109 КОЕ/см3. По полученным данным было установлено, что наибольшее содержание клеток L. reuteri было достигнуто при температуре 37 °С и активной кислотности 6,2 ед. рН. Следует отметить, что максимум концентрации живых клеток в питательной среде наблюдался через 8-10 ч культивирования L. reuteri. При исследовании динамики размножения Lactobacillus reuteri в зависимости от дозы вносимого инокулята и различной продолжительности культивирования использовали активную кислотность 6,2 ед. pH и температуру культивирования 37 °С. В ходе исследований доза инокулята составляла 3, 4, 5, 6, 7 и 8 %. Анализ полученных данных показал, что интенсивность размножения Lactobacillus reuteri зависит от количества внесенного инокулята. Максимальное количество клеток Lactobacillus reuteri отмечалось через 6-8 ч культивирования при внесении 6-7 % инокулята и составило 2×109 КОЕ/см3. В ходе исследований также определяли количество клеток Lactobacillus reuteri в биомассе, полученной после культивирования при внесении различных доз инокулята, после ее отделения на суперцентрифуге. Наибольшее количество клеток Lactobacillus reuteri накапливалось при получении биомассы после отделения клеток на суперцентрифуге при внесении 6 % инокулята и составило 1011 КОЕ/см3. Выводы 1. Наибольшее количество клеток было получено при культивировании L. reuteri в питательной среде с гидролизованным молоком при использовании протеолитического фермента Alcalase в количестве 3 % от содержания белка в среде. Оптимальный состав питательной среды состоял из 96,75 % гидролизованного молока, 3 % дрожжевого экстракта, 0,25 % инулина и обеспечивал интенсивное развитие и накопление клеток Lactobacillus reuteri. 2. При исследовании влияния активной кислотности среды и температуры культивирования L. reuteri на накопление клеток было установлено, что оптимальной температурой культивирования является температура 37 °С и активная кислотность 6,2 ед. рН. Количество клеток при данных параметрах составляло 1,4×109 КОЕ/см3. 3. При исследовании влияния дозы вносимого инокулята на интенсивность размножения L. reuteri установлено, что максимальное количество клеток L. reuteri отмечалось через 6-8 ч культивирования при внесении 6-7 % инокулята (2×109 КОЕ/см3). 4. Установлено, что наибольшее количество клеток Lactobacillus reuteri накапливалось при получении биомассы после отделения клеток на суперцентрифуге при внесении 6 % инокулята и составило 1011 КОЕ/см3.
1. Stoyanova, L.G. Antimikrobnye metabolity molochnokislyh bakteriy: raznoobrazie i svoystva (obzor) / L.G. Stoyanova, E.A. Ustyugova, A.N. Netrusov // Prikladnaya biohimiya i mikrobiologiya. - 2012. - T. 48. - № 3. - S. 644-650.
2. Izuchenie antibioticheskogo kompleksa, obrazuemogo Lactococcus lactis subsp. Lactis 194 variant - K / E.A. Ustyugova [i dr.] // Mikrobiologiya. - 2011. - T. 80. - № 5. - S. 644-685.
3. Elizete de F.R. Pancheniak. Molecular characterization and biomass and metabolite production of Lactobacillus reuteri LPB P01-001: A potential probiotic/ Elizete de F.R. Pancheniak, Maike T. Maziero, Jose A. Rodriguez-Leon, Jose L. Parada, Michele R. Spier, Carlos R. Soccol// Brazilian Journal of Microbiology. - 2012. -P. 135-147.
4. Filipe Santos. Effect of amino acid availability on vitamin B12 production in Lactobacillus reuteri/ Filipe Santos, Bas Teusink, Douwe Molenaar, Maurice van Heck, Michiel Wels, Sander Sieuwerts, Willem M. de Vos, Jeroen Hugenholtz// Applied and environmental microbiology. - V. 75. - N 12. - 2009. - P. 3930-3936.
5. Zakonomernosti gidroliza syvorotochnyh belkov ekzo- i endoproteazami / T.N. Golovach, N.V. Gavrilenko, N.K. Zhabanos, V.P. Kurchenko // Trudy BGU. - 2008. - T. 3. - Ch. 1. - S. 1-15.
6. Golovach, T.N. Kul'tivirovanie molochnokislyh bakteriy v pitatel'nyh sredah na osnove gidrolizatov belkov moloka / T.N. Golovach // Trudy BGU. - 2010. - T. 5. - Ch. 1. - S. 118-126.
7. Golovach, T.N. Gidroliz belkov moloka fermentnymi preparatami i proteoliticheskimi sistemami molochnokislyh bakteriy // Trudy BGU. - 2012. - T. 7. - Ch. 1. - S. 106-120.
8. Magdalena Polak-Berecka, Adam Wasko, Monicka korolowska-Wiater, Marcin Podlesny, Zdzislaw Targonski, Agnieszka Kubik-Komar. Optimization of Medium composition for enhancing growth of lactobacillus rhamnosus PEN using persponse surface methodology// Polish Journal of Microbiology, Vol.59, № 2, 2010, P. 113-118.
9. Konstruirovanie pitatel'noy sredy dlya kul'tivirovaniya probioticheskogo mikroorganizma Lactobacillus reuteri / T.A. Raskoshnaya, V.F. Semenihina, I.V. Rozhkova, A.V. Begunova // Molochnaya promyshlennost'. - 2015. - № 4. - S. 26-27.
10. Smirnov, E.A. Sovershenstvovanie nauchnyh i razrabotka prakticheskih aspektov biotehnologii monovidovyh bakterial'nyh koncentratov molochnokislyh mikroorganizmov dlya syrodeliya: avtoref. dis.. kand. tehn. nauk / E.A. Smirnov. - Vologda, 2011.
11. Metodicheskie rekomendacii po organizacii proizvodstvennogo mikrobiologicheskogo kontrolya na predpriyatiyah cel'nomolochnoy i molochno-konservnoy promyshlennosti / Registracionnoe svidetel'stvo № 12253 ot 26.02.2009. - M., 2009.
