Dairy industry Dairy industry Молочная промышленность 1019-8946 92277 10.21603/1019-8946-2024-6-17 Научная статья Research Article Научная статья Recombinant chymosin of Camelus dromedarius in Pichia pastoris expression system: Purification and Enzymatic Profile Рекомбинантный химозин Camelus dromedarius в экспрессионной системе Pichia pastoris: очистка и анализ ферментативных свойств Антонова Елена Ивановна Antonova Elena I.

доктор биологических наук;

doctor of sciences in biology;

 Фирсова Наталья Викторовна Firsova Natalya V.

кандидат биологических наук;

candidate of sciences in biology;

 Ленгесова Наталья Анатольевна Lengesova Natalya A.

кандидат биологических наук;

candidate of sciences in biology;

 Викторов Денис Александрович Viktorov Denis A.

кандидат биологических наук;

candidate of sciences in biology;

 Ачилов Атабег Батырович Achilov Atabeg B. Торутанов Павел Сергеевич Torutanov Pavel S. Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова Ульяновск Россия Ulyanov State Pedagogical University Ulyanovsk Russian Federation Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова Ульяновск Россия Ulyanov State Pedagogical University Ulyanovsk Russian Federation Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова Ульяновск Россия Ulyanov State Pedagogical University Ulyanovsk Russian Federation Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова Ульяновск Россия Ulyanov State Pedagogical University Ulyanovsk Russian Federation Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова, Ульяновск Россия Ulyanov State Pedagogical University Ulyanovsk Russian Federation Ульяновский государственный педагогический университет имени И. Н. Ульянова Ульяновск Россия Ulyanov State Pedagogical University Ulyanovsk Russian Federation 23 12 2024 23 12 2024 6 82 92 30 10 2024 01 12 2024 https://moloprom.kemsu.ru/en/nauka/article/92277/view

Выделение природного химозина сопряжено с этическими проблемами и высокими экономическими затратами. В связи с этим цель нашего исследования – очистка рекомбинантного химозина Camelus dromedarius (rChn-Cam), полученного в экспрессионной системе Pichia pastoris, с оптимизацией к росту клеточных колоний к различным питательным средам в присутствии различных концентраций зеоцина и анализ ферментативной активности. Последовательность гена прохимозина получена из NCBI BLAST. В качестве штамма-продуцента использовали GS115/his4 P. рastoris. Для конструирования экспрессионной кассеты использовали вектор pPICZ(alpha)B с промотором AOXI. В работе применяли генно-инженерные методы; культивирование штамма; выделение рекомбинантных His-Tag-меченных белков методом металл-аффинной хроматографии, ПААГ-электрофореза и Western-blot анализ. Молекулярную массу определяли методом MALDI-TOF MS, концентрацию – спектрофотометрически. После разработки челночной экспрессионной плазмиды pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT отмечено, что наращивание клеточной массы P. рastoris GS115/his4 (фенотип Mut+) целесообразнее проводить с предварительным внесением 0,5 % метанола. После трансформации P. pastoris GS115/his4 и получения штамма-продуцента P. рastoris/pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT отмечена сопряженность между скоростью прироста клеточной массы и концентрациями зеоцина в среде YPD («не обогащенная» с 50, 100 и 200 мкг/мл зеоцина) и YPD («обогащенная», биотин 0,00004 % и 1 % глицерина, с 50, 100 и 200 мкг/мл зеоцина), согласно которой штамм-продуцент целесообразно выращивать в «обогащенной» среде с концентрацией зеоцина 50 мкг/мл. После выделения и очистки масса rChn-Cam составила 35,673 кДа. При повышении рН субстрата с 5,0 до 6,5 коагуляционная активность снижалась на 24 %. Порог термической инактивации rChn-Cam составил 40–45 °C. Единица активности свертываемости снижается при увеличении концентрации зеоцина. Выявлена противоположная зависимость концентрации rChn-Cam от времени начала свертывания субстрата. Таким образом, полученный нами rChn-Cam в экспрессионной системе P. рastoris является хорошей альтернативой rChn, который используется при производстве сыров.

Natural chymosin production is an expensive and complex process associated with ethical issues. The article introduces recombinant chymosin Camelus dromedarius (rChn-Cam) isolated from a P. pastoris expression system and optimized for different nutrient media at different zeocin concentrations. The sequence of prochymosin gene was obtained from NCBI BLAST. GS115/his4 P. prastoris served as a producer strain. The pPICZ(alpha) B vector with the AOXI promoter made it possible to construct the expression cassette. The experiment involved methods of genetical engineering and strain cultivation. The recombinant His-Tag-labelled proteins were isolated by the method of metal-affinity chromatography and analyzed using PAG electrophoresis and Western-blot analysis. The molecular weight was determined by MALDI-TOF MS while the concentration was defined spectrophotometrically. The shuttle expression plasmid pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT revealed that the cell mass expansion of P. pastoris GS115/his4 (Mut+) should be performed with a preliminary introduction of 0.5% methanol. After the transformation of P. pastoris GS115/his4 and obtaining a strain-producer of P. pastoris/pPICZ(alpha)B/proCYM_camel_pp_IDT, the rate of cell mass gain started to correlate with the zeocin concentrations in two different media. Medium YPD was not fornified and contained 50, 100, and 200 μg/mL zeocin. MediumYPD was fortified with 0.00004% biotin and 1% glycerol and included 50, 100, and 200 μg/mL zeocin. The strain-producer grew better in the medium with a zeocin concentration of 50 μg/mL. The mass of rChn-Cam was 35.673 kDa after isolation and purification. When the pH of the substrate rose from 5.0 to 6.5, the coagulation activity decreased by 24%. The thermal inactivation threshold of rChn-Cam was 40–45°C. The unit of coagulation activity decreased as the zeocin concentration went up. The rChn-Cam concentration was in inverse correlation with the substrate coagulation time. In this research, the rChn-Cam obtained in the expression system of P. prastoris proved to be a good alternative to rChn used in the cheese industry.

 генетическая конструкция рекомбинантный химозин Camelus dromedarius вектор плазмида дрожжи Pichia pastoris молокосвертывающая активность термостабильность очистка химозина genetic construct recombinant chymosin Camelus dromedarius vector plasmid yeast Pichia pastoris milk-setting activity thermostability chymosin purification Работа подготовлена в рамках выполнения государственного задания «Разработка способа очистки ферментов, как продукта генетически сконструированной экспрессионной системы». Дополнительное соглашение №073-03-2024-060/1 от 13.02.2024 к Соглашению о предоставлении субсидии из федерального бюджета на финансовое обеспечение выполнения государственного задания на оказание государственных услуг (выполнения работ) № 073-03-2024-060 от 18.01.2024, заключенным между ФГБОУ ВО «УлГПУ им. И. Н. Ульянова» и Министерством просвещения Российской Федерации. Регистрационный номер 124102300757-8.

Foltmann, B. Prochymosin and chymosin (prorennin and rennin) / B. Foltmann // Biochemical Journal. 1969. № 115. P. 3–4. https://doi.org/10.1042/bj1150003p Foltmann, B. Prochymosin and chymosin (prorennin and rennin) / B. Foltmann // Biochemical Journal. 1969. № 115. P. 3–4. https://doi.org/10.1042/bj1150003p Wang, N. Expression and characterization of camel chymosin in Pichia pastoris / N. Wang [et al.] // Protein Expression and Purification. 2015. № 111. P. 75–81. https://doi.org/10.1016/j.pep.2015.03.012 Wang, N. Expression and characterization of camel chymosin in Pichia pastoris / N. Wang [et al.] // Protein Expression and Purification. 2015. № 111. P. 75–81. https://doi.org/10.1016/j.pep.2015.03.012 Uniacke-Lowe, T. Chymosin, pepsins and other aspartyl proteinases: Structures, functions, catalytic mechanism and milk-clotting properties // Cheese. Chemistry, Physics and Microbiology / T. Uniacke-Lowe, P. F. Fox. – UK: Academic Press, 2017. – Р. 69–113. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-417012-4.00004-1 Uniacke-Lowe, T. Chymosin, pepsins and other aspartyl proteinases: Structures, functions, catalytic mechanism and milk-clotting properties // Cheese. Chemistry, Physics and Microbiology / T. Uniacke-Lowe, P. F. Fox. – UK: Academic Press, 2017. – R. 69–113. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-417012-4.00004-1 Akishev, Z. Obtaining of recombinant camel chymosin and testing its milk-clotting activity on cow’s, goat’s, ewes’, camel’s and mare’s milk / Z. Akishev, S. Aktayeva, A. Kiribayeva // Biology. 2022. № 11. e1545. https://10.3390/biology11111545 Akishev, Z. Obtaining of recombinant camel chymosin and testing its milk-clotting activity on cow’s, goat’s, ewes’, camel’s and mare’s milk / Z. Akishev, S. Aktayeva, A. Kiribayeva // Biology. 2022. № 11. e1545. https://10.3390/biology11111545 Мягконосов, Д. С. Протеолитическая активность молокосвертывающих ферментов разного происхождения / Д. С. Мягконосов, Д. В. Абрамов, И. Н. Делицкая, Е. Г. Овчинникова // Пищевые системы. 2022. Т. 5, № 1. С. 47–54. https://doi.org/10.21323/2618-9771-2022-5-1-47-54; https://elibrary.ru/fkaojb Myagkonosov, D. S. Proteoliticheskaya aktivnost' molokosvertyvayuschih fermentov raznogo proishozhdeniya / D. S. Myagkonosov, D. V. Abramov, I. N. Delickaya, E. G. Ovchinnikova // Pischevye sistemy. 2022. T. 5, № 1. S. 47–54. https://doi.org/10.21323/2618-9771-2022-5-1-47-54; https://elibrary.ru/fkaojb Akishev, Zh. Milk-clotting activity of recombinant bovine and camel chymosin for cow's, goat's and ewes' milk / Zh. Akishev [et al.] // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2023. № 2. P. 61–68. https://doi.org/10.11134/btp.2.2023.8; https://elibrary.ru/ukhqoj Akishev, Zh. Milk-clotting activity of recombinant bovine and camel chymosin for cow's, goat's and ewes' milk / Zh. Akishev [et al.] // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2023. № 2. P. 61–68. https://doi.org/10.11134/btp.2.2023.8; https://elibrary.ru/ukhqoj Balabova, D. V. Biochemical properties of a promising milk-clotting enzyme, Moose (Alces alces) recombinant chymosin / D. V. Balabova [et al.] // Foods. 2023. Vol. 12. № 20. e3772. https://doi.org/10.3390/foods12203772 Balabova, D. V. Biochemical properties of a promising milk-clotting enzyme, Moose (Alces alces) recombinant chymosin / D. V. Balabova [et al.] // Foods. 2023. Vol. 12. № 20. e3772. https://doi.org/10.3390/foods12203772 Мурашкин, Д. Е. Анализ некоторых биохимических свойств рекомбинантного химозина сибирской косули (Capreolus pygargus), полученного в культуре клеток млекопитающих (CHO-K1) / Д. Е. Мурашкин, С. В. Беленькая, А. А. Бондарь [и др.] // Биохимия. 2023. Т. 88. Вып. 9. С. 1556–1569. https://doi.org/10.31857/S0320972523090087; https://elibrary.ru/wwnnwk Murashkin, D. E. Analiz nekotoryh biohimicheskih svoystv rekombinantnogo himozina sibirskoy kosuli (Capreolus pygargus), poluchennogo v kul'ture kletok mlekopitayuschih (CHO-K1) / D. E. Murashkin, S. V. Belen'kaya, A. A. Bondar' [i dr.] // Biohimiya. 2023. T. 88. Vyp. 9. S. 1556–1569. https://doi.org/10.31857/S0320972523090087; https://elibrary.ru/wwnnwk Gilliland, G. L. The three-dimensional structure of recombinant bovine chymosin at 2.3 Å resolution / G. L. Gilliland [et al.] // Proteins. 1990. № 8. P. 82–101. https://doi.org/10.1002/prot.340080110 Gilliland, G. L. The three-dimensional structure of recombinant bovine chymosin at 2.3 Å resolution / G. L. Gilliland [et al.] // Proteins. 1990. № 8. P. 82–101. https://doi.org/10.1002/prot.340080110 Holt, C. Invited review: Caseins and the casein micelle: Their biological functions, structures, and behavior in foods // C. Holt [et al.] // Journal of Dairy Science. 2013. № 96. P. 6127–6146. https://doi.org/10.3168/jds.2013-6831 Holt, C. Invited review: Caseins and the casein micelle: Their biological functions, structures, and behavior in foods // C. Holt [et al.] // Journal of Dairy Science. 2013. № 96. P. 6127–6146. https://doi.org/10.3168/jds.2013-6831 Lopes-Marques, M. Unusual loss of chymosin in mammalian lineages parallels neo-natal immune transfer strategies / M. Lopes-Marques, R. Ruivo, E. Fonseca // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2017. № 116. P. 78–86. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2017.08.014 Lopes-Marques, M. Unusual loss of chymosin in mammalian lineages parallels neo-natal immune transfer strategies / M. Lopes-Marques, R. Ruivo, E. Fonseca // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2017. № 116. P. 78–86. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2017.08.014 Akishev, Z. Constitutive expression of Camelus bactrianus prochymosin B in Pichia pastoris / Z. Akishev [et al.] // Heliyon. 2021. Vol. 7(5). e07137. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e07137 Akishev, Z. Constitutive expression of Camelus bactrianus prochymosin B in Pichia pastoris / Z. Akishev [et al.] // Heliyon. 2021. Vol. 7(5). e07137. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e07137 Flamm, E. L. How FDA approved chymosin: A case history / E. L. Flamm // BioTechnology. 1991. № 9. P. 349–351. https://doi.org/10.1038/nbt0491-349 Flamm, E. L. How FDA approved chymosin: A case history / E. L. Flamm // BioTechnology. 1991. № 9. P. 349–351. https://doi.org/10.1038/nbt0491-349 Johnson, M. E. A 100-Year Review: Cheese production and quality / M. E. Johnson // Journal of Dairy Science. 2017. № 100. P. 9952–9965. https://doi.org/10.3168/jds.2017-12979 Johnson, M. E. A 100-Year Review: Cheese production and quality / M. E. Johnson // Journal of Dairy Science. 2017. № 100. P. 9952–9965. https://doi.org/10.3168/jds.2017-12979 Balabova, D. V. Biochemical and technological properties of moose (Alces alces) recombinant chymosin / D. V. Balabova, A. P. Rudometov, S. V. Belenkaya // Journal of Genetics and Breeding. 2022. Vol. 26, № 3. P. 240–249. https://doi.org/10.18699/VJGB-22-31; https://elibrary.ru/wnatqw Balabova, D. V. Biochemical and technological properties of moose (Alces alces) recombinant chymosin / D. V. Balabova, A. P. Rudometov, S. V. Belenkaya // Journal of Genetics and Breeding. 2022. Vol. 26, № 3. P. 240–249. https://doi.org/10.18699/VJGB-22-31; https://elibrary.ru/wnatqw da Silva, R. R. Evaluation of the milk clotting properties of an aspartic peptidase secreted by Rhizopus microspores // R. R. da Silva [et al.] // Preparative Biochemistry and Biotechnology. 2020.Vol. 50(3). P. 226-233. https://doi.org/10.1080/10826068.2019.1683861 da Silva, R. R. Evaluation of the milk clotting properties of an aspartic peptidase secreted by Rhizopus microspores // R. R. da Silva [et al.] // Preparative Biochemistry and Biotechnology. 2020.Vol. 50(3). P. 226-233. https://doi.org/10.1080/10826068.2019.1683861 Bansal, N. Suitability of recombinant camel (Camelus dromedarius) chymosin as a coagulant for Cheddar cheese / N. Bansal [et al.] // International Dairy Journal. 2009. Vol. 19 (9). P. 510–517. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2009.03.010 Bansal, N. Suitability of recombinant camel (Camelus dromedarius) chymosin as a coagulant for Cheddar cheese / N. Bansal [et al.] // International Dairy Journal. 2009. Vol. 19 (9). P. 510–517. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2009.03.010 Moynihan, A. C. Effect of camel chymosin on the texture, functionality, and sensory properties of low-moisture, part-skim Mozzarella cheese / A. C. Moynihan // Journal of Dairy Science. 2014. Vol. 97(1). P. 85–96. https://doi.org/10.3168/jds.2013-7081 Moynihan, A. C. Effect of camel chymosin on the texture, functionality, and sensory properties of low-moisture, part-skim Mozzarella cheese / A. C. Moynihan // Journal of Dairy Science. 2014. Vol. 97(1). P. 85–96. https://doi.org/10.3168/jds.2013-7081 González-Velázquez, D. A. Exploring the milk-clotting and proteolytic activities in different tissues of Vallesia glabra: a new source of plant proteolytic enzymes / D. A. González-Velázquez [et al.] // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2021. Vol. 193. P. 389–404. https://doi.org/10.1007/s12010-020-03432-5 González-Velázquez, D. A. Exploring the milk-clotting and proteolytic activities in different tissues of Vallesia glabra: a new source of plant proteolytic enzymes / D. A. González-Velázquez [et al.] // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2021. Vol. 193. P. 389–404. https://doi.org/10.1007/s12010-020-03432-5 Sbhatu, D. B. Ficus palmata FORSKÅL (BELES ADGI) as a source of milk clotting agent: a preliminary research / D. B. Sbhatu, H. T. Tekle, K. H. Tesfamariam // BMC Research Notes. 2020. Vol. 13. P. 446. https://doi.org/10.1186/s13104-020-05293-x Sbhatu, D. B. Ficus palmata FORSKÅL (BELES ADGI) as a source of milk clotting agent: a preliminary research / D. B. Sbhatu, H. T. Tekle, K. H. Tesfamariam // BMC Research Notes. 2020. Vol. 13. P. 446. https://doi.org/10.1186/s13104-020-05293-x Беленькая, С. В. Разработка продуцента рекомбинантного химозина марала на основе дрожжей Kluyveromyces lactis / С. В. Беленькая, В. В. Ельчанинов, Д. Н. Щербаков // Биотехнология. 2021. Т. 37, № 5. С. 20–27. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2021-37-5-20-27; https://elibrary.ru/qzyxec Belen'kaya, S. V. Razrabotka producenta rekombinantnogo himozina marala na osnove drozhzhey Kluyveromyces lactis / S. V. Belen'kaya, V. V. El'chaninov, D. N. Scherbakov // Biotehnologiya. 2021. T. 37, № 5. S. 20–27. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2021-37-5-20-27; https://elibrary.ru/qzyxec Синицын, А. П. Получение промышленно важных ферментов на основе экспрессионной системы гриба Penicillium verruculosum / А. П. Синицын, О. А. Синицына, А. М. Рожкова // Биотехнология. 2020. Т. 36. № 6. С. 17–34. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2020-36-6-17-34; https://elibrary.ru/qyxxah Sinicyn, A. P. Poluchenie promyshlenno vazhnyh fermentov na osnove ekspressionnoy sistemy griba Penicillium verruculosum / A. P. Sinicyn, O. A. Sinicyna, A. M. Rozhkova // Biotehnologiya. 2020. T. 36. № 6. S. 17–34. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2020-36-6-17-34; https://elibrary.ru/qyxxah Baghban, R. Yeast expression systems: overview and recent advances / R. Baghban [et al.] // Molecular Biotechnology. 2019. Vol. 61(5). P. 365–384. https://doi.org/10.1007/s12033-019-00164-8 Baghban, R. Yeast expression systems: overview and recent advances / R. Baghban [et al.] // Molecular Biotechnology. 2019. Vol. 61(5). P. 365–384. https://doi.org/10.1007/s12033-019-00164-8 Patra, P. Recent advances in systems and synthetic biology approaches for developing novel cell-factories in non-conventional yeasts / P. Patra [et al.] // Biotechnology Advances. 2021. № 47. e107695. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107695 Patra, P. Recent advances in systems and synthetic biology approaches for developing novel cell-factories in non-conventional yeasts / P. Patra [et al.] // Biotechnology Advances. 2021. № 47. e107695. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107695 Jensen, J. L. Camel and bovine chymosin: the relationship between their structures and cheese-making properties / J. L. Jensen [et al.] // Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 2013. Vol. 69. P. 901–913. https://doi.org/10.1107/S0907444913003260 Jensen, J. L. Camel and bovine chymosin: the relationship between their structures and cheese-making properties / J. L. Jensen [et al.] // Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 2013. Vol. 69. P. 901–913. https://doi.org/10.1107/S0907444913003260 Fox, P. F. Enzymatic coagulation of milk // Fundamentals of Cheese Science / P. F. Fox [et al.]. New York: Springer, 2017. – P. 185–229. https://doi.org/10.1007/978-1-4899-7681-9_7 Fox, P. F. Enzymatic coagulation of milk // Fundamentals of Cheese Science / P. F. Fox [et al.]. New York: Springer, 2017. – P. 185–229. https://doi.org/10.1007/978-1-4899-7681-9_7 Беленькая, С. В. Основные биохимические свойства рекомбинантных химозинов (обзор) / С. В. Беленькая, Д. В. Балабова, А. Н. Белов [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2020. Т. 56, № 4. С. 315–326. https://doi.org/10.31857/S0555109920040030; https://elibrary.ru/ahzlih Belen'kaya, S. V. Osnovnye biohimicheskie svoystva rekombinantnyh himozinov (obzor) / S. V. Belen'kaya, D. V. Balabova, A. N. Belov [i dr.] // Prikladnaya biohimiya i mikrobiologiya. 2020. T. 56, № 4. S. 315–326. https://doi.org/10.31857/S0555109920040030; https://elibrary.ru/ahzlih Gumus, P. Effects of blends of camel and calf chymosin on proteolysis, residual coagulant activity, microstructure, and sensory characteristics of Beyaz peynir / P. Gumus, A. A. Hayaloglu // Journal of Dairy Science. 2019. Vol. 102(7). P. 5945–5956. https://doi.org/10.3168/jds.2018-15671 Gumus, P. Effects of blends of camel and calf chymosin on proteolysis, residual coagulant activity, microstructure, and sensory characteristics of Beyaz peynir / P. Gumus, A. A. Hayaloglu // Journal of Dairy Science. 2019. Vol. 102(7). P. 5945–5956. https://doi.org/10.3168/jds.2018-15671 Al-Zoreky, N. S. Using recombinant camel chymosin to make white soft cheese from camel milk // N. S. Al-Zoreky, F. S. Almathen // Food Chemistry. 2021. № 337. e127994. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.127994 Al-Zoreky, N. S. Using recombinant camel chymosin to make white soft cheese from camel milk // N. S. Al-Zoreky, F. S. Almathen // Food Chemistry. 2021. № 337. e127994. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.127994 Беленькая, С. В. Разработка продуцента рекомбинантного химозина марала на основе дрожжей Kluyveromyces lactis / С. В. Беленькая, В. В. Ельчанинов, Д. Н. Щербаков // Биотехнология. 2021. Т. 37. № 5. С. 20–27. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2021-37-5-20-27; https://elibrary.ru/qzyxec Belen'kaya, S. V. Razrabotka producenta rekombinantnogo himozina marala na osnove drozhzhey Kluyveromyces lactis / S. V. Belen'kaya, V. V. El'chaninov, D. N. Scherbakov // Biotehnologiya. 2021. T. 37. № 5. S. 20–27. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2021-37-5-20-27; https://elibrary.ru/qzyxec Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. 1970. Vol. 227(5259). P. 680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0 Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. 1970. Vol. 227(5259). P. 680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0 Рудометов, А. П. Исследование ферментативной стабильности жидких препаратов рекомбинантного химозина коровы (Bos taurus taurus L.) / А. П. Рудометов, С. В. Беленькая, Д. Н. Щербаков [et al.] // Сыроделие и маслоделие. 2017. № 6. С. 40–43. https:// elibrary.ru/zudmcr Rudometov, A. P. Issledovanie fermentativnoy stabil'nosti zhidkih preparatov rekombinantnogo himozina korovy (Bos taurus taurus L.) / A. P. Rudometov, S. V. Belen'kaya, D. N. Scherbakov [et al.] // Syrodelie i maslodelie. 2017. № 6. S. 40–43. https:// elibrary.ru/zudmcr Ageitos, J. M. Purification and characterization of a milk-clotting protease from Bacillus licheniformis strain USC13 / J. M. Ageitos [et al.] // Journal of Applied Microbiology. 2007. № 103(6). P. 2205–2213. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2007.03460.x Ageitos, J. M. Purification and characterization of a milk-clotting protease from Bacillus licheniformis strain USC13 / J. M. Ageitos [et al.] // Journal of Applied Microbiology. 2007. № 103(6). P. 2205–2213. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2007.03460.x Malik, A. A review on Pichia pastoris: A successful tool for expression of recombinant proteins / A. Malik, A. Gupta, S. Dahiya [et al.] // The Pharma Innovation Journal. 2021. Vol. 10(11). P. 550–556. Malik, A. A review on Pichia pastoris: A successful tool for expression of recombinant proteins / A. Malik, A. Gupta, S. Dahiya [et al.] // The Pharma Innovation Journal. 2021. Vol. 10(11). P. 550–556.