Введение Горячий источник Абаканский Аржан находится в Таштыпском районе республики Хакасия (51°47’53.9»N 88°15’01.1»E). Согласно гидро- химическим и геоструктурным исследованиям воды источника кремнистые, имеют нейтральный рН 7,2 и температуру 37–40 °С [1, 2]. Т. А. Олигер исследовал химический состав воды источника Абаканский Аржан (табл. 1) [3]. На большое содержание кремниевых кислот в составе оказывает влияние температура и давление. Содержание кремниевых кислот выше 100 мг/л характерно для высокотермальных вод с темпе- ратурой ˃ 70 °С [1]. Экстремофилы – это микроорганизмы, способные жить и размножаться в экстремальных условиях среды. Существует множество классов экстремофилов, классифицированные по условиям окружающей среды. В отношении микробного набора термальных источников можно выделить наиболее изученные рода, среди которых экстремофильные прокариоты- деструкторы водорода, сероводорода, метана и других простых газов, а также сложных полимеров [ 4, 5]. Данные об изучении микробиоты источника Абаканский Аржан отсутствуют. Однако, согласно существующим исследованиям, термальные источники со схожим химическим составом обладают уникальным микробным сообществом, отдельные представители которого могут использоваться для создания микробных топливных элементов с целью получения чистой энергии [5–8]. Микробные топливные элементы – это биоэлектрическая система, включающая анод и катод, разделенные специальной мембраной, и применяющаяся с целью получения электроэнергии по средствам окисления субстрата, находящегося в камере, с помощью микроорганизмов. Это перспективные и безопасные источники энергии. Данные установки схожи в техническом ис- полнении и применяемых материалах. Основой установок является камера или цилиндр, содержащие питательную среду или субстрат. Зависит это от штаммов микроорганизмов, которые применяются в технологии, а также от цели культивирования. Общий принцип работы микробных топливных элементов заключается в анаэробном окислении субстрата биологическим материалом в анодной камере, отделенной от катодной ионоселективной мембраной. В результате микроорганизмы отдают на анод электроны различными способами. Из-за перехода ионов, имеющих положительный заряд, в катодную область и скапливании электронов на аноде возникает разность потенциалов, генерирующая электрический ток. Мембрана представляет собой небольшой канал, который сужается посередине и находится между катодной и анодной камерами. Она не дает смешиваться средам в камерах. Таким образом, в анодной камере происходит окисление, а в катодной восстановление [9, 10]. Электроны в микробных топливных элементах образуются в процессе сложных биохимических реакций, которые катализируются бактериями [6, 11]. Выбор биокатализатора зависит от субстрата, который определяет мощность и эффективность микробных топливных элементов. Исследовано микробное сообщество бактерий, которое вырабатывало до 0,3 мА [12]. Бактерии, идентифицированные S. Ishii и др. как относящиеся к роду Rhizobiales, составляли основную популяцию микробных топливных элементов, в котором в качестве единственного источника углерода выступала целлюлоза. Учеными отмечалась уникальная морфология исследуемых изолятов: наличие нитевидных придатков, которые играют важную роль в электрогенном сообществе, разлагающем целлюлозу. H. Rismani-Yazdi и др. для выработки энергии использовали микробное сообщество, выделенное из рубца крупного рогатого скота [13]. В результате удалось достичь силы тока в 1,5 мА. Однако генерируемая мощность микробных топливных элементов на основе подобных микробных сообществ низкая. Интересными представляются результаты работ, авторы которых использовали бактерии, восстанавливающие металлы в качестве био- катализаторов в микробных топливных эле- ментах. К таким относят Geobacter, Shewanella, Rhodopseudomonas, Clostridium и др. [14–24]. Серия исследований показала, что Geobacter и Shewanella используют электропроводящие внеклеточные нити (нанопроволока) для переноса электронов на твердые акцепторы, такие как графитовые аноды. Механизм переноса электронов хорошо изучен именно на примере указанных родов. Данные микроорганизмы признаны модель- ными объектами при исследовании микробного Таблица 1. Химический состав воды источника Абаканский Аржан Table 1. Chemical composition of water from the Abakan Arzhan spring Элемент Содержание мг/л мг-экв/л экв-% Калий 2,00 ± 0,10 0,05 ± 0,01 1,00 ± 0,10 Натрий 30,00 ± 0,50 1,33 ± 0,10 29,00 ± 0,50 Магний 12,00 ± 0,30 1,00 ± 0,30 22,00 ± 0,45 Кальций 43,00 ± 0,60 2,10 ± 0,10 47,00 ± 0,60 Фтор – – – Хлор 21,00 ± 0,40 0,60 ± 0,05 13,00 ± 0,25 Оксид серы 21,00 ± 0,40 0,45 ± 0,60 10,00 ± 0,20 Гидрокарбонаты 214,00 ± 0,90 3,52 ± 0,15 77,00 ± 0,70 Кремниевые кислоты 75,00 ± 0,70 – – Минерализация 422,00 ± 0,80 – – 461 Дмитриева А. И. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2022. Т. 52. № 3. С. 458–468 электросинтеза и металлоредукции [12, 25, 26]. В основе переноса электронов ключевую роль играют мультигемовые цитохромы. Это белки, которые обеспечивают перенос электронов от цитоплазматической мембраны бактериальной клетки на внешнюю оболочку [27, 28]. Однако многие базовые вопросы, касающиеся микробиологии генерации электричества (микробного электросинтеза), до сих пор остаются без ответа. Микробные топливные элементы для производства электроэнергии позволяют использовать разно- образные субстраты: от чистых соединений до сложных смесей органических веществ, присутствующих в сточных водах. Субстрат включает в себя как органические, так и неорганических материалы. Существует множество субстратов, на которых могут расти экстремофильные бак- терии [14, 16, 18, 27]. Однако ученые сходятся во мнении, что выращивать такие штаммы в лабораторных условиях сложно, т. к. эволюционно сообщества данных бактерий выживали в среде с недостатком водорода и кислорода, поэтому их использование и культивирование в лабораторных условиях требует тщательного подхода и понимания факторов конкурентной борьбы микробиологических сообществ за энергию [7, 14]. В лабораториях применяются методы, которые предполагают выращивание больших партий клеток и измерение активности белков. Это сложный и трудоемкий процесс. Другие методы основаны на разрушении клеточных структур, очистке и исследовании белков [18, 27, 28]. В качестве питательной среды для таких штаммов учеными предлагается использовать либо стандартные лабораторные среды, либо отходы, содержащие органические соединения [3, 4, 13, 17]. Целью настоящей работы является выявление и анализ бактериальных изолятов источника Абаканский Аржан для поиска ключевых продуцентов микробной энергии. Объекты и методы исследования Объектами исследования являлись образцы воды и ила термального источника Абаканский Аржан (Россия, Республика Хакасия, Таштыпский район, 51°47›53.9»N 88°15›01.1»E) и полученные на следующих этапах исследований бактериальные изоляты. Сбор образцов проводили в августе – сентябре 2020 г. Пробы по 25 г ила и 25 мл воды отбирали в стерильные контейнеры. Площадь отбора одной точки составляла от 10 до 30 см2. Глубина отбора от 10–30 см ниже уровня донных отложений (табл. 2). Каждый отбор производили в 3-х повторностях. Герметичные контейнеры с образцами хранили при температуре 4,0 ± 0,5 °С до доставки в лабораторию. Для получения накопительных культур изолятов готовили 10 % суспензии образцов и высевали на минимальные питательные среды. В качестве источника углерода и донора электронов в минимальных питательных средах использовали 10 мМ ацетата, а также 40 мМ фумарата в качестве акцептора электронов. Общую микробную численность определяли методом Коха. Чашки Петри инкубировали при температуре 37 °С в течение 72 ч. Учитывали число колоний, вырастающих при посеве 1 мл пробы на чашку Петри. Морфологию изолятов, наличие пилей и чехла наблюдали с помощью электронного микроскопа (Carl Zeiss, Германия) по стандартным методикам [29, 30]. Также применяли люминесцентную микроскопию на инверсионном микроскопе AxioVert.A1 (Carl Zeiss, Германия) с применением красителя акридинового оранжевого. Для выявления термотолерантных и экстре- мофильных изолятов чашки Петри инкубировали при значениях температуры 30–60 °С с шагом 5 °С. Оптимум pH для изолятов определяли по методике измерения удельной скорости роста изолята . Выделенные изоляты подвергали консервации при температуре –80 °С. Для выявления способности будущих изолятов к железоредукции использовали среды, которые содержат Fe(CH3COO)3 и Fe(NO3)3, впервые предло- женные профессором D. RLovley для выращивания железоредуцирующих бактерий, усовершенствованные в последующем [31]. Дополнительно к среде добавляли витамины, микроэлементы и дрожжевой экстракт [32]. Инкубировали при 37,0 ± 0,5 °С в течение 72 ч, строго соблюдая анаэробные условия СО2 в инкубаторе ИЛМ-170-01 (Lamsystems, Россия). Методику определения способности штаммов к железоредукции подробно описали C. Merino и др. [33]. Авторы использовали фотоколориметрический метод, основанный на определении количества ионов железа (II). Для этого в 500 мкл среды, содержащей Таблица 2. Схема отбора образцов из источника Абаканский Аржан Table 2. Sampling scheme from the Abakan Arzhan spring № Тип образца Объем/ масса Глубина отбора (для ила от уровня донных отложений), см pH Температура, °С 1 Вода 25 мл 30 6,8 26,5 2 Вода 25 мл 100 6,9 37,8 3 Вода 25 мл 300 7,2 40,0 4 Ил 25 г 10 7,1 25,5 5 Ил 25 г 20 7,2 30,0 6 Ил 25 г 30 7,5 31,7 462 Dmitrieva A.I. et al. Food Processing: Techniques and Technology. 2022;52(3):458–468 суспензию изолятов, вносили равное количество α,ά-дипиридила. Доводили объем до 3 мл и выдер- живали в темном месте в течение 30 мин. После образцы исследовали на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм и определяли концентрацию ионов Fe2+ в мг/л с помощью построения калибровочного графика. Для метагеномного анализа микробного сообщества экстрагировали нуклеиновые кислоты из образцов с использованием наборов DNEasy PowerSoil Kit и RNeasy PowerSoil Total RNA Kit (Qiagen, Германия). Выделение проводили согласно протоколам производителя. Для экстракции нуклеиновых кислот из нако- пительных культур использовали наборы DNEasy Kit и RNeasy Kit (Qiagen, Германия). Выделение проводили согласно протоколам производителя. Качество выделенных нуклеиновых кислот и оценку целостности РНК определяли на системе капиллярного электрофореза с автосемплером на 8 образцов Qsep1 (Bioptic, Тайвань). Амплификацию выделенных фрагментов проводили прямым методов, согласно протоколу, описанному G. Muyizer с коллегами [34]. Для амплификации 16 S РНК использовали праймеры 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1525R (5’-AAGGAGGTGWTCCARCC) [30, 35]. Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе АНК-32 (Синтол, Россия) в режиме реального времени при следующих условиях: цикл при 94 °С для денатурации двуцепочечной молекулы ДНК в течение 5 мин, затем 30 циклов при 95 °С в течение 0,5 мин, 55 °С в течение 0,5 мин, 72 °С в течение 1,5 мин и заключительный этап удлинения при 72 °С в течение 10 мин. Для рестрикции использовали HaeIII, HhaI, MnlI, Sau3AI, TaqI. Секвенирование нуклеотидных последователь- ностей проводили на платформе MiSeq (Illumina, США) с применением NGS технологий. Для работы использовали готовый набор реагентов от производителя Reagent Kit v3 (Illumina, США). Работу вели по протоколам прибора c незначительными модификациями. Биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК проводили по базе данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), используя алгоритм BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). В случае необходимости проводили редактирование полученных последовательностей с помощью BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Для анализа 16S РНК микробиотического сооб- щества использовали библиотеку Silva (https:// www.arb-silva.de), где представлены комплексные, проверенные на качество и регулярно обновляемые наборы данных выровненных последовательностей малых (16S/18S, SSU) и больших субъединиц (23S/28S, LSU) рибосомных РНК (рРНК) для трех доменов: бактерии, археи и эукариоты [36]. Филогенетический анализ проводили с исполь- зованием программы MEGA11 (https://www. megasoftware.net). Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам с использованием Таблица 3. Разнообразие представителей таксона Bacteria в пробах воды и ила Table 3. Bacterial diversity in water and silt samples Номер пробы 1 2 3 4 5 6 Филотип Процент от общего числа последовательностей в библиотеке, % Firmicutes 34,674 23,456 54,254 34,567 29,755 13,194 Bacteroides 14,973 9,082 11,493 2,973 3,083 2,194 Thiobacillus – – – – – 1,038 Betaproteobacteria – – – 0,234 6,234 25,992 Thermomonas 0,274 3,682 10,763 15,972 17,254 45,723 Gammaproteobacteria – – 3,742 10,234 10,422 16,274 Proteobacteria 56,962 48,862 36,872 62,722 45,724 33,834 Actinobacteria – – 3,761 5,621 – 10,672 Минорные филотипы Процент от общего числа последовательностей в библиотеке, % Sulfurospirillum – – – 0,001 – – Geobacter 0,001 0,001 0,004 0,001 0,029 0,085 Shewanella – – 0,001 0,003 0,078 0,098 Pseudomonas – 0,001 0,001 – – – Achromobacter – – 0,001 – – 0,001 Clostridium – – – – – – 463 Дмитриева А. И. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2022. Т. 52. № 3. С. 458–468 программного пакета Microsoft Excel 2010 для Windows 7. Для полученных данных рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение. Результаты и их обсуждение Результаты исследования бактериального разно- образия филотипов в образцах воды и ила приведены в таблице 3. В таблице 3 представлены данные по филотипам, для которых средних процент находки выше 1 %. Доминирующими филотипами, которые удалось установить для проб воды, являются Firmicutes, Bacteroides и Proteobacteria, для проб ила – Firmicutes, Thermomonas, Gammaproteobacteria и Proteobacteria. C целью упрощения поиска железоредуцирующих изолятов был произведен анализ минорных фило- типов, который подтвердил присутствие в пробах РНК Geobacter и Shewanella, в меньшем количестве – Pseudomonas, Sulfurospirillum и Achromobacter. Общее количество полученных накопительных культур из образцов, собранных на источнике Абаканский Аржан, – 9. Данные исследования морфологических и физиологических свойств представлены в таблице 4. В ходе изучения морфологических и физиологических характеристик изолятов инте- ресными с точки зрения дальнейших исследо- ваний представляются изоляты № 1 и 2. Данные представители микробиоты термального источника Абаканский Аржан обладают выраженными экстремофильными свойствами: рост на среде с pH 8,0–8,5, рост при температуре 40 ± 2 и 45 ± 2 °С соответственно. На рисунке 1 представлены два вида устойчивых колонии (изоляты № 1 и 2) на плотной питательной среде. Состав указан в [31]. Морфологические характеристики изолятов представлены на рисунке 2. Оба изолята на разных стадиях роста имели палочковидную форму. Средняя длина и ширина клеток изолята № 1 составила 4,50 ± 0,08 и 0,80 ± 0,03 мкм, изолят № 2 обладал средней длиной и шириной 2,20 ± 0,05 и 0,60 ± 0,02 мкм соответственно. Для изолята 2 наблюдалась незначительное образо- вание диплолочковидных клеток при переходе Таблица 4. Морфологические и физиологические свойства изолятов Table 4. Morphological and physiological properties of isolates Изолят Свойства № 1 № 2 № 3 № 4 № 5 № 6 № 7 № 8 № 9 Длина клетки, мкм 4,50 ± 0,08 2,20 ± 0,05 0,80 ± 0,01 2,80 ± 0,02 3,20 ± 0,06 1,90 ± 0,01 0,70 ± 0,01 2,70 ± 0,05 2,20 ± 0,05 Наличие чехла – – – – – – – – – Оптимальное значение рН 8,0–8,5 8,0–8,5 7,0–8,0 7,0–8,0 6,0–6,5 7,0–8,0 7,5–8,5 7,0–8,0 7,0–8,0 Оптимальная температура, °С 40 ± 2 45 ± 2 35 ± 2 33 ± 2 37 ± 2 36 ± 2 33 ± 2 37 ± 2 37 ± 2 Аэробный рост в темноте + + + – – – + + – Наличие пилей + + – – ± – ± – – «+» – присутствие признака; «–» – отсутствие признака; «±» – сомнительный признак. “+” – sign detected; “–” – no sign detected; “±” – a doubtful s ign Рисунок 1. Изоляты, полученные на среде, содержащей Fe(CH3COO)3) и Fe(NO3)3. Изображение колоний после 48 ч инкубации Figure 1. Isolates obtained on a medium containing Fe(CH 3COO)3 and Fe(NO3)3 after 48 h of incubation Изолят № 1 Изолят № 2 464 Dmitrieva A.I. et al. Food Processing: Techniques and Technology. 2022;52(3):458–468 в экспоненциальную стадию роста. Подобные клетки представляют собой недавно разделившиеся клетки. Рост на среде, содержащей ацетат железа (III) и нитрат железа (III), свидетельствует о процессе Fe(III)-восстановления у исследуемых изолятов. На рисунке 3 представлено содержание ионов Fe(II), мкг/мл, в зависимости от изолята . Очевидны железоредуцирующие свойства выделенных изолятов. С увеличением времени культивирования содержание ионов железа зна- чительно повышается. Это связано с процессом Fe(III)-восстановления в исследуемых образцах. На графиках роста содержания ионов Fe(II) заметны статистические отклонения, которые появляются через 48 ч культивирования. Авторы объясняют это отличиями в способности штаммов к железоредукции. Интенсивнее восстановление железа проходит в образце с изолятом № 2 после 72 ч культивирования (409 мкг/мл). Однако изолят № 1 также показал существенные редуцирующие свойства спустя 72 ч – 407 мкг/мл. Интересна разница показателей при достижении 48 ч культивирования: изолят № 2 – 250 мкг/мл, изолят 1 – всего 165 мкг/мл. Культивирование более 72 ч является нецеле- сообразным, т. к. результаты исследования под- тверждают наличие железоредуцирующих свойств у исследуемых изолятов. Филогенетический анализ изолятов, основанный на сравнении нуклеотидных последовательностей 16S РНК, показал, что штаммы близки между собой и относятся к известным видам (рис . 4 и 5). Данные филогенетического анализа 16S РНК позволяют отнести изолят № 1 к роду Shewanella, а изолят № 2 к роду Geobacter. Оба этих таксона включают в себя обширные группы сульфид- и желе- зоредуцирующих бактерий, способных накапливать электрический заряд на своей поверхности [32, 37]. Таким образом, из источника Абаканский Аржан удалось выделить 2 вида железоредуцирующих бактерий: Shewanella algae и Geobacter sulfurreducens. Выводы Проблема выработки чистой энергии на сегодняшний день стоит крайне остро. Верным с точки зрения экологии и защиты окружающей среды является применение технологий микробного синтеза электроэнергии. Этот способ производства электричества основывается на способности штаммов микроорганизмов генерировать протоны водорода в среде, содержащей необходимый субстрат. При этом эмиссия CO2 отсутствует. Некоторые микро- организмы-экстремофилы способны потреблять органические вещества и генерировать энергию. Интерес представляет микробиота горячих источников. По известным данным роды Shewanella и Geobacter имеют электропроводящие отростки, облегчающие прямой перенос электронов. Они способны превращать органические отходы, в том числе токсичные, в менее опасные вещества и производить в процессе электричество. Если эта система будет усовершенствована, то микроорганизмы помогут решить две взаимосвязанные глобальные проблемы – загрязнение окружающей среды и получение чистой энергии. В ходе изучения микробного сообщества тер- мального источника Абакаский Аржан установлено, что доминирующими филотипами являются Firmicutes, Bacteroides и Proteobacteria, Firmicutes, Thermomonas, Gammaproteobacteria и Proteobacteria. Удалось уста- новить наличие схожих последовательностей 16S РНК для филотипов Shewanella и Geobacter в собранных образцах. Это подтверждает теорию о присутствии железоредуцирующих видов в образцах. Рисунок 2. Морфология изолятов в логарифмической стадии роста культур: a – изолят № 1; b – изолят № 2. Данные электронной микроскопии, ×100 Figure 2. Morphology of isolates in the logarithmic stage of culture growth: a – isolate 1; b – isolate 2. Electron microscopy, ×100 a b Рисунок 3. Зависимость содержания ионов Fe(II) от изолята и продолжительности культивирования Figure 3. Effect of isolate and cultivation time on the content of Fe(II) ions 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Изолят № 1 Изолят № 2 Содержание ионов Fe(II), мгк/л 24 ч 48 ч 72 ч 465 Дмитриева А. И. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2022. Т. 52. № 3. С. 458–468 Эксперименты по изоляции отдельных видов микробного сообщества позволили получить 9 накопительных культур, 2 из которых показали рост на среде, содержащей ацетат железа (III) и нитрат железа (III). Это свидетельствует о процессе Fe(III)-восстановления. Интенсивнее восстановление железа проходило в образце с изолятом № 2 (Geobacter sulfurreducens) после 72 ч культивирования (409 мкг/мл). Однако изолят № 1 (Shewanella algae) также показал существенные редуцирующие Рисунок 4. Филогенетическое древо изолята № 1, построенное с помощью метода максимального правдоподобия (Maximum Likelihood). Масштаб эволюционных расстояний соответствует 2 заменам на 100 аминокислот последовательности Figure 4. Phylogenetic tree of isolate 1 by the Maximum Likelih ood method. Evolutionary scale: two substitutions per 100 amino acids Рисунок 5. Филогенетическое древо изолята № 2, построенное с помощью метода максимального правдоподобия (Maximum Likelihood). Масштаб эволюционных расстояний соответствует 2 заменам на 100 аминокислот последовательности Figure 5. Phylogenetic tree of isolate 2 by the Maximum Likelih ood method. Evolutionary scale: two substitutions per 100 amino acids 466 Dmitrieva A.I. et al. Food Processing: Techniques and Technology. 2022;52(3):458–468 свойства 407 мкг/мл. Исходя из представленных данных, актуальным представляется использование и дальнейшее изучение двух видов изолятов, определенных в результате филогенетического и биоинформатического анализов как S. algae и G. sulfurreducens. Представленные результаты исследования легли в основу дальнейших экспериментов, направленных на изучение процесса микробного электросинтеза с помощью выделенных изолятов экстремофильных бактерий, а также на конструирование пробного образца микробных топливных элементов и интенсификацию процесса микробного электро- синтеза. Ближайшие аналоги данной технологии пред- лагают использовать экстремофильные штаммы, не способные активно потреблять органические субстраты. Следовательно, основными отличиями технологии являются не только возможность получения электроэнергии с помощью микробного синтеза, но и переработка сложных органических отходов (включая нативные субстраты сельского хозяйства: коллаген, кератин, эластин). Таким образом, конечной целью применения технологии микробного синтеза авторы ставят утилизацию и очистку сточных вод пищевых и перерабатывающих предприятий [38]. Критерии авторства А. И. Дмитриева руководила научной работой и обеспечивала выполнение экспериментальной части в области молекулярно-биологических исследований. М. Ю. Дроздова и Е. Р. Фасхутдинова обеспечивали выполнение лабораторной части экспериментов по исследованию морфологических и физиологических признаков, а также выделению накопительных культур экстремофльных изолятов. С. С. Кутузов и Л. А. Проскурякова обеспечивали подготовку аналитической части исследования. Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Contribution A.I. Dmitrieva supervised the research and performed the experimental part in the field of molecular biological research. M.Yu. Drozdova and E.R. Faskhutdinova were responsible for the laboratory study of morphological and physiological characteristics, as well as the isolation of enrichment cultures of extreme isolates. S.S. Kutuzov and L.A. Proskuryakova provided the analytical part of the study. Conflict of interest The authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this article.