Введение С учетом важной роли микрофлоры кишечника в формировании иммунобиологической реактивности организма исключительную значимость приобретает создание и использование продуктов функциональ­ного питания на основе микроорганизмов, относя­щихся к нормальным физиологическим обитателям кишечника здорового человека.Согласно современным требованиям, предъяв­ляемым к этим продуктам, пробиотические бактерии должны присутствовать в количестве, соответст­вующем терапевтической дозе (не менее 1·108 КОЕ/г продукта), сохранять жизнеспособность на протяже­нии всего срока хранения продукта и выживать в же­лудочно-кишечном тракте человека. В связи с этим актуально проведение исследований по выбору ме­тода защиты клеток пробиотических культур в не­благоприятных условиях кисломолочных продуктов и желудочно-кишечного тракта. Объекты и методы исследованийДля исследования выбраны следующие биообъ­екты: L. acidophilus штамм La-5; Bifidobacterium lactis штамм BB-12; Streptococcus salivarius subsp. thermophilus; Lactis subsp. diacetilactis; Bifidobacterium bifidum № 1 и их ассоциации. Экспериментальные исследования проводились в 3–5-кратных повторностях по общепринятым, стандартным методам исследований физико-химических, микробиологических и органолептических показателей. Результаты и их обсуждениеОдним из способов получения высокоактивных и устойчивых в агрессивных условиях клеток микро­организмов является иммобилизация методом на­слаивания, т.е. заключение клеток в гидроколлоид­ные мембраны, обеспечивающие защиту клеток, дос­туп питательных веществ и отвод продуктов жизне­деятельности микроорганизмов во внешнюю среду.На основании вышеизложенного, а также сущест­вующих медико-биологических требований к со­ставу и свойствам продуктов функционального пи­тания сформулированы основные требования к ре­зультату процесса иммобилизации культур пробио­тических микроорганизмов, которые заключаются в следующем:– носителем (подложкой) для иммобилизации должны быть биополимеры натурального происхож­дения;– пробиотические культуры после иммобилиза­ции наслаиванием должны иметь вид тонких пласти­нок (мембран);– мембраны должны иметь период распадаемости при растворении от 0,5 до 1,0 ч;– активность пробиотических культур должна поддерживаться в течение всего срока годности мембран и составлять не менее 1·1010 КОЕ/г активи­зированной закваски.При реализации сформулированных требований и выборе носителя для иммобилизации учитывались следующие факторы.Иммобилизацию можно рассматривать как физи­ческое разделение катализатора (клеток) и раствори­теля, при котором молекулы субстрата и продукта могут легко обмениваться между фазами. Важным фактором процесса иммобилизации является выбор биополимера (носителя). Включение живых клеток в гели биополимеров требует мягких условий иммоби­лизации. Носитель при этом должен представлять систему открытых пор с хорошими условиями для газообмена. Биополимеры обладают уникальными способностями загущения, студнеобразования, вла­гоудержания и стабилизации структурно-сложных систем. Для исследования выбраны биополимеры натурального животного и растительного происхож­дения: желатин и пектин. Такой выбор обусловлен следующим. Молекулы желатина и пектина состоят из групп атомов, резко различающихся по характеру взаимодействия с молекулами воды. Длинная мак­ромолекула представляет собой распределение цен­тров взаимодействия с молекулами воды, в результате чего создается гидратная оболочка макромолекулы.Пектины независимо от источника их происхож­дения являются природными ионообменниками, спо­собными замещать водороды карбоксильных групп на катионы поливалентных металлов. Для исследо­ваний выбран цитрусовый пектин марки SLENDID® type 200.Желатин представляет собой смесь полипептидов с различной молекулярной массой. Совместное ис­пользование пектина и желатина на данный момент изучено недостаточно, что позволяет считать прове­дение исследований актуальным.В зависимости от химической природы макромо­лекул и особенностей пищевой системы биополиме­ров возможны различные условия гелеобразования, которые приведены в табл. 1. Таблица 1 Физико-химические показатели действия биополимеров ПоказательПектинЖелатинОптимальный диапазон рН3,6–4,44,5–10,0Условия гелеобразованияАктивная кислотность не менее 4;сахароза – 55–80 %При темпе­ратуре ниже засты-ванияПродолжительность растворения, мин, не более10,025,0 Массовая доля влаги, %, не более12,016,0Массовая доля золы, %, не более1,22,0 Пектин и желатин целесообразно применять для иммобилизации пробиотических культур микроорга­низмов, так как оба биополимера представляют со­бой систему открытых пор с хорошими условиями для газообмена, гели данных биополимеров обладают хорошими диффузными качествами, способны образовывать структуры с оптимальным размером пор. Гелеобразование протекает при рН = 4,0–4,5, что является определяющим условием жизнеспособности пробиотической микрофлоры. Кроме того, желатин является источником глутаминовой кислоты и аргинина, пектин содержит пищевые волокна, которые стимулируют рост жизнеспособных клеток бифидо-бактерий, т.е. обладает свойствами пребиотика. Для выбора количественного соотношения биополимеров были проведены экспериментальные исследования. Все исследования процесса иммобилизации про­водились в строго стерильных условиях специаль­ного бокса, в котором была смонтирована и установ­лена пилотная лабораторная установка для проведе­ния экспериментальных исследований.Эксперимент состоял из последовательных этапов:– подготовка – стерилизация или длительная вы­сокотемпературная пастеризация (98±1) °С и вы­держка (30±5) с обезжиренного молока и охлаждение его до температуры (38±1) °С;– чистые монокультуры, полученные из бактери­альной лаборатории ОНО «ВНИМИ-Сибирь» Рос­сельхозакадемии, инокулировали в подготовленное обезжиренное молоко в соотношении 1:1:1;– в термостате при температуре (38±1) °С активи­зировали ассоциацию пробиотических культур;– одновременно подготавливалась смесь биопо­лимеров, растворенных в соответствии с техниче­ской документацией по использованию изучаемых биополимеров в 0,9 % растворе NaCl, прошедшем обработку при температуре выше 100 °С;– активизированную ассоциацию пробиотических культур соединяли с раствором биополимеров при температуре (35±1) °С и постоянном перемешивании в течение 15–20 мин;– ассоциацию пробиотических культур, иммоби­лизованную в смесь биополимеров, дозировали слоями в стерильные формы, которые выдерживали в течение 15–20 мин в стерильных условиях специ­ального бокса для полученных пленок (мембран). Герметически закрытые формы с мембранами хра­нились при температуре (4±2) °С до использования в экспериментальных исследованиях.Все эксперименты проводились в 3–5-кратной повторности, при этом варьировалось соотношение биополимеров с целью изучения их влияния на каче­ственные характеристики мембран с иммобилизо­ванными пробиотическими культурами. Схема орга­низации эксперимента по определению рациональ­ного соотношения биополимеров представлена в табл. 2. Таблица 2 Схема проведения эксперимента Но­мер опытаКонцентра­ция раствора биополимеров (2:1), %Коли­чество пектина, г/100 гКоли­чество жела­тина, г/100 гКоличество раствора хлористого натрия 0,9 %, мл153,41,6952106,63,49031510,05,08542013,46,68052516,68,475 В зависимости от состава используемой компо­зиции биополимеров качественные показатели мем­бран изменялись.Качество полученных мембран оценивали по физико-химическим, органолептическим и микро­биологическим показателям, представленным в табл. 3 и 4.Анализ полученных данных, представленных в табл. 3, свидетельствует о том, что с увеличением концентрации биополимеров активность воды уменьшается, массовая доля сухих веществ увеличи­вается, активная кислотность не изменяется. Таблица 3 Физико-химические характеристики мембран Номер опы-таМассовая доля сухих веществ, %Динамическая вязкость рас­твора биопо­лимеров, мПа·сАктив­ность воды (aw)Актив­ная кислот­ность, ед. рН15,86±0,128,20,8704,37210,41±0,1010,70,8624,40313,52±0,1513,10,8584,38419,92±0,1318,50,8534,40523,14±0,1524,30,8414,38 Таблица 4 Органолептические показатели мембран Но-меропы-таВнешний видКонси­стенцияВкус и запахЦвет1Мембраны не образуются2Мембраны не образуются3Правильная форма, имеет стандартную массу и раз­мерыМягкие, слабо со­храняющие структуруБез вкуса и за­пахаБелый, с кремо­вым от­тенком4Правильная форма, имеет стандартную массу и раз­мерыУпругие, сохраняю­щие струк­туруБез вкуса и за­пахаБелый, с кремо­вым от­тенком5Правильная форма, имеет стандартную массу и раз­мерыИзлишне упругие, ломкиеБез вкуса и за­пахаБелый, с кремо­вым от­тенком Анализ физико-химических и органолептических показателей полученных мембран (см. табл. 4) сви­детельствует о том, что образование упругих, сохра­няющих и восстанавливающих свою структуру мем­бран происходит при количественном соотношении биополимеров в желирующей системе пектин : жела­тин как 2:1, при общей концентрации сухих веществ 20 % мас.В связи с тем, что функциональные свойства по­лученных мембран зависят не только от наличия в них пищевых веществ, но и от количества жизнеспо­собных клеток пробиотических микроорганизмов, необходимо обеспечить в продукте сохранность жизнеспособных клеток пробиотических микроорга­низмов в течение всего срока годности за счет созда­ния благоприятной ростовой и температурной среды обитания микроорганизмов. Микробиологические исследования проводили в следующих образцах (табл. 5): – контроль – ассоциация пробиотических микро­организмов в активизированной форме: L. acidophilus : B. lactis : S. thermophilus в соотношении 1:1:1;– опыт – ассоциация пробиотических микроорга­низмов в иммобилизованном виде (мембраны).Таблица 5 Количество жизнеспособных клеток пробиотических мик­роорганизмов в мембранах Вари­антОбщее количе­ство молочно­кислых микро-организмов, КОЕ/см3Количе­ство би­фидобак­терий, КОЕ/см3Количество ацидофиль­ной палочки, КОЕ/см3Кон­троль6,5·10102,1·1091,9·1010Опыт5,2·10102,0·1091,7·1010 Анализируя данные, представленные в табл. 5, можно заключить, что степень концентрирования жизнеспособных клеток пробиотических микроорга­низмов в исследуемых мембранах находится в пре­делах установленных требований.Логарифм количества жизнеспособных клеток иммобилизованных микроорганизмов в гель биопо­лимеров представлен на рис. 1.   Рис. 1. Логарифм количества жизнеспособных клеток пробиотических культур, иммобилизованных в гель био­полимеров Таким образом, анализ представленных данных свидетельствует о незначительном снижении сте­пени концентрирования жизнеспособных клеток им­мобилизованных культур микроорганизмов в мем­бранах, что положительно характеризует иммобили­зацию как метод защиты клеток в неблагоприятных условиях.Не менее важным критерием пробиотических свойств заквасок является способность микроорга­низмов приживаться в желудочно-кишечном тракте человека. В связи с этим были проведены исследова­ния по изучению устойчивости иммобилизованных клеток микроорганизмов к желчи, NaCl и щелочной реакции среды, т.е. к веществам желудочно-кишеч­ного тракта. Результаты исследований представлены в табл. 6.В результате исследований было установлено, что иммобилизованные клетки микроорганизмов проявили устойчивость к исследуемым концентра­циям тест-веществ, что может рассматриваться как косвенный показатель лучшей способности иммоби­лизованных клеток микроорганизмов приживаться в желудочно-кишечном тракте человека. Предположи­тельно такая закономерность прослеживается за счет наибольшего количества ассоциированных компо­нентов (протеины, полисахариды) клеточных стенок микроорганизмов, содержащих пектины, которые комплементарны соответствующим рецепторам, расположенным на мембранах эпителиальных кле­ток. Именно пектины, соединения белковой или гли­копротеиновой природы, проявляющие специфиче­скую и обратимую углеводсвязывающую актив­ность, являются медиаторами адгезии, обеспечивая поддержание жизнеспособности пробиотических клеток микроорганизмов, иммобилизованных в гель биополимеров. Таблица 6 Устойчивость иммобилизованных клеток микроорганизмов к веществам желудочно-кишечного тракта УстойчивостьВариантКонтрольОпытК желчи, %30,040,0К фенолу, %0,40,4К NaCl, %6,54,0К щелочной реакции среды, рН8,3–9,68,3–9,2 Проверка степени растворимости мембран по­зволила заключить, что период распадаемости мем­бран составляет от 0,5 до 1,0 ч.Результаты изучения перевариваемости белков исследуемых мембран пищеварительными фермен­тами (in vitro) свидетельствуют о том, что по сравне­нию с контрольным опытные образцы характеризу­ются лучшей перевариваемостью.Для биологических продуктов (пробиотиков), обогащенных функциональными ингредиентами в виде ассоциации культур, приоритетным показате­лем является уровень клеточной концентрации про­биотических микроорганизмов, достигнутый вслед­ствие использования закваски и технологических па­раметров производства. Это положение в полной мере относится к мембранам клеток ассоциации культур, иммобилизованных в гель биополимеров. Производители заквасок используют различные ме­тоды пролонгирования их срока годности: замора­живание, высушивание и др.Для длительного хранения иммобилизованных клеток микроорганизмов в виде мембран (пластинок) использовали консервирование высушиванием при низких температурах с целью снижения влияния процесса термоинактивации молочнокислых микро­организмов и бифидобактерий и создания условий, приводящих их в анабиотическое состояние.Сублимационная сушка (лиофилизация) – са­мый современный и перспективный метод консерви­рования пищевых продуктов, обеспечивающий наи­более совершенное высушивание с максимальным сохранением природных, пищевых, органолептиче­ских и биологических свойств продукта и генетиче­скую стабильность основных свойств пробиотиче­ских культур в неблагоприятных условиях. Сублимационную сушку мембран осуществ­ляли в производственной сушильной установке марки TG 50. Использовали стандартные условия для высушивания заквасок, приведенные в блок-схеме (рис. 2).  Замораживаниеtполок = минус 40 °С, τ = 4 ч, tпр. конеч = минус (47±2) °С Сублимацияtполок = 35 °С, tисп = минус (54±2) °С, Р = 20 Па, τ = 12 ч Десорбцияtполок = 25 °С, tисп = минус (60±2) °С, Р = 8 Па, τ = 8 ч   Рис. 2. Блок-схема высушивания мембран на сублима­ционной сушилке марки TG 50 Свежие и сухие мембраны измельчали, расфасо­вывали в сухие стерильные флаконы и помещали на хранение. Был установлен режим холодильного хра­нения при температуре (4±2) °С. Для определения срока годности была разработана программа, состав­ленная в соответствии с рекомендациями МУК 4.2.1847-04, и установлена периодичность исследований.Сравнительная гистограмма жизнеспособных клеток пробиотических культур микроорганизмов в процессе хранения мембран представлена на рис. 3.   Рис. 3. Сравнительная гистограмма жизнеспособных клеток пробиотических культур микроорганизмов в про­цессе хранения мембран Гарантированный срок хранения мембран, не подвергнутых сублимационной сушке, составляет 18 сут., сухих мембран – 90 сут. при температуре (4±2) °С.По результатам исследований разработана тех­нология бактериального концентрата пробиотиче­ских культур, иммобилизованных в гель биополиме­ров, и нормативная документация. Апробация бакте­риального концентрата проводилась на молочном предприятии г. Омска ОНО «ВНИМИ-Сибирь» Рос­сельхозакадемии.На жизнеспособность микроорганизмов влияет большое количество самых разнообразных факторов: изменение температуры, состав питательных ве­ществ, рН, давление и др.В процессе роста и развития культур микроорга­низмов могут одновременно протекать три различ­ных взаимосвязанных процесса:– процесс роста активной части популяции, при котором происходит увеличение численности актив­ных (размножающихся) клеток;– процесс пассивации активных клеток, в резуль­тате которого часть популяции переходит в пассив­ное (пассивированное) состояние;– процесс отмирания пассивной части популяции, приводящий к гибели пассивных клеток.Учеными ОмГАУ также изучен процесс микро­капсулирования микроорганизмов в гель полимеров. Известно, что микрокапсулирование – это процесс включения микрочастиц (в данном случае микроор­ганизмов) в тонкую оболочку (матрицу) пленкообра­зующего материала. В качестве матрицы можно ис­пользовать желатин, агар, альгинат, пектин, крахмал. Наряду с природными широкое применение находят и синтетические полимеры (полиакриламидный гель, полиуретаны, поливиниловый спирт и др.) [1].При выборе биополимеров для получения более эффективного результата необходимо учесть ряд аспектов:– формирование желаемой текстуры продукта – образование микрокапсул сферической формы;– подготовка и дозировка биополимера для дос­тижения необходимого эффекта – формирование тонкой пленки;– температура микрокапсулирования;– особенности каждого биополимера – рН, хими­ческий состав, условия гелеобразования;– размеры и свойства микрокапсул.В зависимости от химической природы макро­молекул и особенностей пищевой системы выбраны следующие пленкообразователи (табл. 7). Для проведения исследований была разработана пилотная установка, состоящая из специального бокса, бактерицидного излучателя, штатива, магнитной мешалки, сита (размер ячеек 1,4 мм) и др.В боксе поддерживались асептические условия, манипуляции проводились через специальные отвер­стия. Суспензию активизированных микроорганиз­мов соединяли с раствором биополимеров при тем­пературе (38±1) °С и затем через нижнее отверстие осуществляли перемещение раствора капельным пу­тем в раствор хлористого натрия для формирования микрокапсул и их затвердевания. На основании результатов экспериментов, про­веденных в 5-кратной повторности, установлено, что для капсулирования микроорганизмов с использова­нием желатина, пектина и крахмала рациональным является соотношение 5:1:1. В результате образуются стойкие, однородные, упругие капсулы, сохраняющие свою структуру.Преимуществами желатина как носителя явля­ются его доступность, возможность получения раз­личных форм – гранул, пластин, мембран и т.д., на­личие различных функциональных групп, а также то, что гелеобразование желатина не зависит от рН и не требует присутствия других реагентов. Таблица 7 Характеристика биополимеров Наименова­ниеРаство­римость в воде при тем­пературе, °СОпти­мальный диапазон рН, ед.Условиягеле-образованияГену пектин LM-106 AS-YA 202,5–5,5Активная ки­слотность не менее 4,0 ед.Желатин Выше 604,5–10,0При темпера­туре ниже за­стыванияКрахмал204–7При темпера­туре ниже за­стывания Таблица 8 Физико-химические характеристикирастворения (распада) капсул ПоказательРастворительмолокожелудочный сокТемпература, °С 36–3836–38Активнаякислот­ность, рН7,06,4–6,7Время, ч0,20,33 Применение пектина, обладающего способно­стью вывода из организма тяжелых металлов, позво­ляет решить проблему профилактического питания для групп населения, проживающего в промышленно развитых городах. Также пектин оказывает стимули­рующее действие на клетки микроорганизмов.Крахмал, в свою очередь, создает хорошие ус­ловия для газообмена; обладая высокой степенью гидрофильности, обеспечивает возможность связы­вания клеток микроорганизмов с носителем. Ком­плексное использование желатина, пектина и крах­мала в качестве носителя для иммобилизации позво­ляет получить стойкие, однородные, упругие кап­сулы, сохраняющие структуру.Важным параметром, характеризующим опыт­ные образцы капсул, является их способность к по­степенному растворению. Одним из параметров твердых форм, которому придают большое значение, является время распада и (или) скорость растворения in vitro. Для твердых капсул под распадом понима­ется полное растворение в среде испытания (молоко или искусственный желудочный сок) при данной температуре (20 или 37 °С). Этот процесс распада должен завершаться за указанное время (Европей­ская фармакопея регламентирует 30 мин). Фактиче­ская скорость растворения зависит от многих факто­ров: температуры, рН, смачиваемости, плотности частиц и др. Результаты приведены в табл. 8.На основании сравнения полученных результа­тов можно сделать вывод, что капсулы из смеси же­латина, пектина и крахмала быстрее растворяются в молоке, чем в желудочном соке. Для исследования процесса хранения пробио­тических микроорганизмов выбран режим холодиль­ного хранения при температуре (4±2) °С. В свежих образцах капсул определены следующие показатели: общее количество жизнеспособных клеток микроор­ганизмов, в том числе бифидобактерий и ацидо­фильной палочки, органолептические показатели, активность воды (табл. 9).    Таблица 9 Физические, микробиологические и органолептические показатели опытных образцов капсул Объект исследованияАктивность водыКоличество микроорганизмов, КОЕ/гОрганолептическиепоказателиобщеев том числевнешний вид и консистенциязапахбифидобактерийацидофильной палочкиОпытные образцы капсул0,8715,9·10103,2·1094,5·1010Стойкие, сферической формы, упругиеОтсутствует   Срок годности микроорганизмов в микрокапсулированном виде при температуре хранения (4±2) °С составляет 15 сут.Большая часть исследовательских работ связана с поиском наилучшего способа обработки заквасок с целью сохранения активности микроорганизмов, входящих в их состав. Одним из таких способов является замораживание. Известны различные режимы заморозки и, соответственно, хранения замороженных культур.Нами исследован процесс замораживания опытных образцов капсул в морозильной камере Liebherr GN 2356 с температурой замораживания минус 18–20 °С. При этом учитывались рекомендации, представленные в научных трудах профессора О.Н. Буянова (КемТИПП), и метод, предложенный профессорами Э.И. Гуйго и А.З. Волынец, согласно которому исследуемые продукты замораживают в холодильной камере при температуре минус 18–20 °С в виде пластины со строгим соблюдением одинаковой толщины слоя (по 0,001 м каждый слой) [2–4].Капсулы просеивали через лабораторные сита с различным диаметром отверстий. Затем капсулы распределяли по размерам в три слоя с различной толщиной слоев: 1 – 0,9–1,0 мм; 2 – 0,7–0,8 мм;       3 – 0,5–0,6 мм, которые замораживали при температуре минус 18 °С и фиксировали время замораживания (ч). После этого проводили расчет эффективной скорости замораживания, при этом основным критерием был выбран показатель – количество жизнеспособных клеток пробиотических микро-организмов после замораживания.Скорость замораживания является важной характеристикой процесса замораживания. Средняя скорость замораживания – отношение толщины замороженного слоя ко времени его образования [5] – определяется по формуле                                      (1) где u – средняя скорость замораживания, см/ч;           d – толщина замороженного слоя, см; t – время, ч.При этом существует определение, что замораживание продукта со скоростью до 0,5 см/ч – медленное, 0,5–3,0 см/ч – ускоренное, 3–10 см/ч – быстрое, 10–100 см/ч – сверхбыстрое.Расчеты позволили определить, что скорость замораживания опытных продуктов u = 0,05 см/ч. При таком режиме степень выживания общего количества жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов составляет (90,0±5,0) % от их первоначального количества, установленного до замораживания.После хранения капсул при температуре минус (18±2) °С в течение различного периода времени капсулы размораживали при комнатной температуре до положительных температур и проводили их органолептическую оценку (внешний вид, консистенция), химические исследования и микробиологические: определяли остаточное количество жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов. Для оценки жизнеспособности пробиотических микроорганизмов в микрокапсулированном виде использованы коэффициенты [6]:            (2)                                    (3)     где Ксн – коэффициент среднесуточного снижения численности клеток микроорганизмов; Пж – показатель жизнеспособности клеток микроорганизмов;    lg КОЕn – логарифм численности клеток микроорганизмов на конечном этапе хранения; lg КОЕ0 – логарифм численности клеток микроорганизмов на начальном этапе хранения; Т – продолжительность хранения.Результаты расчетов представлены в табл. 10 и 11. Таблица 10 Степень выживаемости клеток пробиотических микроорганизмов в микрокапсулированном виде ПоказательКоличество жизнеспособных клеток, КОЕ/гобщееколичествобифидо-бактерийацидофильной палочкиКсн0,150,130,16Пж6,677,696,25 На основании анализа результатов экспериментальных данных по комплексному исследованию химических, микробиологических, органолептических характеристик определен срок годности       закваски  на  основе  ассоциации  пробиотических  Таблица 11 Степень выживаемости клеток пробиотических микроорганизмов в микрокапсулированном виде после замораживания ПоказательКоличество жизнеспособных клеток, КОЕ/гобщее количествобифидо-бактерийацидофильной палочкиКсн0,0160,0150,015Пж62,50066,67063,690 микроорганизмов в микрокапсулированном виде при температуре (4±2) °С – 15 сут., при температуре минус 18 °С – 5 месяцев (150 сут.) [7–9].С использованием бактериальных концентратов культур в иммобилизованном и микрокапсулированном виде разработаны технологии ряда кисломолочных продуктов с пробиотиками:– ферментированный десертный продукт (пудинг) СТО 00456243-010-2007;– кисломолочный продукт «Премиум» СТО 5638524-008-2010;– биопродукт СТО 49527279-005-2008 и др.Научная новизна технологий отражена в патентах № 2380912 РФ «Способ получения ферментированного продукта из пахты» и № 2368144 РФ «Способ производства десертного продукта».