ВведениеВ настоящее время не теряет актуальности вопрос о снижении риска распространения различных ин­фекций через продукты питания. Повышение био­безопасности продуктов питания и по сей день оста­ется сложной задачей, одним из путей решения ко­торой является создание в продуктах конкурентной микробиологической среды, препятствующей разви­тию болезнетворной и гнилостной микрофлоры. Вносимая в продукт полезная микрофлора способна не только снизить риск развития патогенных и гни­лостных микроорганизмов, но и привнести функцио­нальные характеристики [1–4].Одной из важнейших групп симбионтной микро­флоры человека является род Bifidobacterium. Впер­вые бифидобактерии были выделены и охарактери­зованы в 1900 г. учеником И.И. Мечникова, фран­цузским ученым Henry Tissier. Бифидобактерии были описаны как ветвеобразные, как правило, не обра­зующие газ анаэробные микроорганизмы с бифурка­циями на концах, присутствующие в фецес грудных детей. Изначально микроорганизм получил обозна­чение Bacillus bifidus и был отнесен к роду Lactoba­cillus, но в 1960 г. был отнесен в самостоятельный род Bifidobacterium [2, 3, 5].Представители рода Bifidobacterium являются ес­тественными обитателям толстого кишечника детей и взрослых людей, при этом множество видов обла­дает немалым количеством позитивных эффектов на организм хозяина [5]. Бифидобактерии, постоянно присутствующие в желудочно-кишечном тракте и на лизистых человека и животных, принимают участие в морфогенезе и функциях различных систем орга­низма-хозяина – пищеварительной, иммунной, сер­дечно-сосудистой, эндокринной и др. Это происхо­дит за счет участия бифидобактерий в обмене бел­ков, липидов, углеводов, а также благодаря боль­шому количеству продуцируемых биологически ак­тивных веществ: ферментов, экстрацеллюлярных белков, полисахаридов [2, 3, 4]. Антагонистическая активность бифидобактерий связана с продукцией органических кислот (ацетата и лактата), бактерио­цинов, а также с блокированием сайтов адгезии на слизистой кишечника, что предотвращает фиксацию на них потенциально патогенных микроорганизмов и обусловливает важнейшую роль бифидобактерий в колонизационной резистентности [2, 4, 5].Благодаря продуктам антагонистической актив­ности в отношении патогенной и гнилостной микро­флоры бифидобактерии представляют собой значи­тельный интерес как защитный агент продуктов пи­тания [1, 3, 5]. Особенно важна антагонистическая активность штаммов бифидобактерий в отношении Staph. аureus, E. Coli, Salmonella, Bacillus cereus, Pseudomonas, Yersinia, Listeria, поскольку эти мик­роорганизмы даже в малых количествах в пищевых продуктах представляют значительную угрозу безо­пасности пищи, а значит, и здоровью населения [3, 5].В данной работе описывается ряд исследований, направленных на получение ценного штамма бифи­добактерий и изучение его биологических и техноло­гических характеристик.  Условия экспериментаИспользуемый в исследовании штамм Bifido-bacterium bifidum GG-72 (ВКПМ-АС-1884) был выделен из фецес здорового человека и хранится в коллекции промышленных штаммов микроорганиз­мов кафедры «Технология молока и молочных про­дуктов» ГОУ ВПО МГУПП, а также во Всероссий­ской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика.Объектом сравнения биологических и технологи­ческих свойств служили новый неидентифицирован­ный штамм Bifidobacterium 771 и Bifidobacterium adolescentis BGV-11 (ВКПМ-АС-1742). Штамм   BGV-11 обладает выраженными антагонистическими свойствами против широкого спектра патогенных и гнилостных микроорганизмов, успешно прошел пол­ный цикл клинических испытаний и рекомендован для использования в пищевой и фармацевтической промышленности [6].Очистка от посторонней микрофлоры. Очистку проводили рассеиванием исследуемого материала на селективные питательные среды с добавлением ан­тибиотика диклоксацилина (Sigma-Aldrich,    Герма­ния) [3].Условия культивирования. Штамм GG-72 культи­вировали анаэробно при (37,5±1) °С на поверхности плотной питательной среды или в высоком столбике полужидкой питательной среды. Были использованы следующие питательные среды: MRS-агар (HiMedia, Индия) c добавлением 0,05 % L-цистеин-гидрохло­рида (Serva, Германия); полужидкая тиогликолевая питательная среда (Центр прикладной микробиоло­гии и биотехнологии, г. Оболенск), ГМК-1, ГМК-2 (БиоКомпас-С, г. Углич). Анаэробные условия соз­давали с помощью анаэростата AnaeroPack (Mitsubishi Gas Chemical Company, Япония), газоге­нераторов GENbox anaer (bioMérieux, Франция). На­личие анаэробных условий контролировали индика­торами анаэробности (Oxoid, Англия) [3, 7, 8].Перед каждым экспериментом готовили свежую 17-часовую культуру не менее 3-й генерации. При этом в стерильную питательную среду засевали 0,1 % культуры бифидобактерий предыдущей генера­ции.Генетическая идентификация. При генетической идентификации проводили рассев культуры до от­дельной колонии и получали биомассу для анализа 16S рРНК. Выделение ДНК, подбор праймеров и ре­жимов ПЦР осуществляли по соответствующим ме­тодикам [8–10]. Консервативные праймеры для на­работки гена, кодирующего 16S рРНК: 8f – aga gtt tga tcc tgg ctc ag; 926r – ccg tca att cct ttr agt tt; 1492r – ggt tac cct tgt tac gac tt. Режимы реакции: 1 – 95 °С –           3 мин; 2 – 35 циклов: а) 95 °С – 30 с; б) 57 °С – 30 с;  в) 72 °С – 1 мин 30 с; г) 72 °С – 5 мин.Секвенирование последовательности гена, коди­рующего 16S рРНК, проведено на автоматическом секвенаторе АЕ3000. Далее полученные секвенсы сравнивали и строили деревья родства. Для анализа секвенсов и построения филогенетических деревьев родства были использованы базы данных GenBank и Ribosomal Database Project-II (RDP-II) [12].Стабильность воспроизведения результатов обес­печена проведением не менее трех повторностей ПЦР.Условия электрофореза продуктов ПЦР иссле­дуемых образцов были следующими: 1,0 % агароз­ный гель, электрофорез при напряженности электри­ческого поля 5 В/см [9].Видовая идентификация штамма проведена на базе ФГУП ГосНИИгенетика – ВКПМ, г. Москва.Подтверждение безопасности. Штамм GG-72 проверяли на безвредность и нетоксичность. Иссле­дование проводили на лабораторной линии стериль­ных белых мышей.Изучение динамики роста. Динамика роста штамма GG-72 была изучена в промежутке от 0 до  24 часов. Исследования вели в сравнении с референс-штаммом BGV-11 (ВКПМ-АС-1742). В ходе эксперимента оценивали измене­ние количества клеток, оптической плотности и ки­слотности культуральной жидкости.Оптическую плотность измеряли на фотометре КФК-3-01-ЗОМЗ, кислотность измеряли с помощью рН-метра рН-150МИ с электродом ЭСК-10605/7.Экспериментальные образцы готовили через ряд последовательных десятикратных разведений, доби­ваясь в результате количества клеток близкого к          lg 5 КОЕ/см3. Количество клеток подтверждали микро­биологическими посевами образцов инокулята и культуры в 0 часов роста на плотные питатель­ные среды.Результаты исследования динамики роста учиты­вали через 72 часа культивирования при (37,5±1) °С; исследование изменений кислотности культуральной жидкости вели непосредственно в ходе экспери­мента.Антагонистическая активность. Антагонисти­ческую активность бифидобактерий определяли ме­тодом развивающихся смешанных популяций в сравнении с ростом патогенных тест-культур в мо­нокультуре. В качестве представителей патогенных микроорганизмов использовали штаммы E. coli O157 и Staph. aureus 209-P, полученные из коллекции ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича». Оценку антаго­нистических свойств проводили в сравнении со штаммами бифидобактерий BGV-11 и 771. Культуры тест-микроорганизмов готовили на скошенном мясо-пептонном агаре. Совместное культивирование про­водили на тиогликолевой питательной среде (Центр прикладной микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск).Эксперимент проводили по соответствующим методикам, описанным в литературе [1, 3, 8, 13].Исследование с патогенными микроорганизмами проводили на базе испытательного центра «Биотест» при ГОУ ВПО МГУПБ.Определение технологических свойств и показа­телей, косвенно характеризующих выживаемость в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ). Эксперимент со штаммом GG-72 по оценке технологических свойств и выживаемости в ЖКТ проводили путем культивирования в высоком столбике тиогликолевой питательной среды, которая для создания специфи­ческих условий роста бифидобактерий была моди­фицирована путем внесения специфических добавок для создания следующих характеристик:– NaCl: 2 %, 4 %, 6,5 %;– фенол: 0,4 %;– желчь: 20 %, 40 %;– рН: 5,5; 7,2; 8,3.Была использована желчь крупного рогатого скота. Значение рН питательной среды устанавли­вали с помощью стерильных растворов соляной ки­слоты и гидроксида натрия. После внесения добавок среды стерилизовали. После стерилизации рН среды дополнительно контролировали.Модифицированные питательные среды засевали культурой в объемном соотношении 6 %, ресуспен­дировали, исключая дополнительную аэрацию. Опытные и контрольный образцы инкубировали при температуре (37,5±1) °С в течение (36±1) ч.Рост и развитие штамма GG-72 при разных усло­виях культивирования оценивали визуально в срав­нении с контрольными культурами [1]. Результаты и их обсуждениеНовый штамм Bifidobacterium bifidum GG-72 был выделен из фецес здорового человека, поэтому он изначально носит природный характер и имеет осно­вание к обладанию статусом GRAS (Generally recognized as safe) в рамках рода Bifidobacterium.Произведена очистка штамма от посторонней микрофлоры с применением антибиотика диклоксациллина, а также первичная идентификация по фено­типическимкультурально-морфологическим призна­кам. Полученный штамм Bifidobacterium bifidum GG-72 обладает основными характерными для своего рода культурально-морфологическими и тинкториальными характеристиками (рис. 1).    Рис. 1. Колонии штамма GG-72 в полужидкой питательной среде. Клетки штамма GG-72  Полученные данные позволяют заключить, что штамм GG-72 обладает типичными для рода Bifidobacterium признаками и представляет собой грамположительные клетки с бифуркациями, распо­лагающиеся одиночно или в группах, клеточная стенка с неравномерными утолщениями. На поверх­ности плотной питательной среды образует мелкие и точечные колонии (1 мм и менее 1 мм) молочного цвета полужидкой, слегка тянущейся консистенции с характерным уксусно-кисломолочным запахом.Штамм GG-72 способен давать рост на типичных для рода Bifidobacterium питательных средах: тиог­ликолевая, ГМК-1, ГМК-2, МРС с добавлением     0,05 % L-цистеингидрохлорида.Генетическая идентификация. Проведена ам­плификация последовательности гена, кодирующего 16S рРНК с помощью консервативных праймеров входе ПЦР. Вариабельные участки гена 16S рРНК се­квенированы, получена их нуклеотидная последова­тельность.Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадле­жит к следующим систематическим группам: домен Bacteria; отдел Firmicutes; тип Actinobacteria; класс Actinobacteria; подкласс Actinobacteridae; порядок Bifidobacteriales; семейство Bifidobacteriaceae; род Bifidobacterium. Установлено, что гомология с видом рода Bifidobacterium bifidum cоставляет 98 %. Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы, находящейся на сайте RDB II (Ribosomal Database Project II), предназна­ченной для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев, представ­лены на рис. 2 в графическом виде. Идентифицируе­мый штамм обозначен как «uknown» [11, 12].   Рис. 2. Филогенетическое древо штамма GG-72 (обозначен как «uknown») с гомологичными штаммами бифидобактерий  Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97 %. По данному критерию исследуемый штамм можно отнести к виду Bifidobacterium bifidum. Отнесение штамма GG-72 к виду B. bifidum носит позитивный характер. Это обосновано принадлежностью вида к неофициальной группе бифидобактерий истинно «человеческого» происхождения и содержания этого вида до 51,9 % от общего объема микрофлоры ЖКТ у детей на грудном вскармливании [2, 14]. Вид          B. bifidum способен при определенных условиях развиваться в молочном сырье, что позволяет его рекомендовать для применения в технологии молочных продуктов [2, 3, 15]. Эти факты усиливают нашу уверенность в выборе штамма для применения с позиции функционального компонента.Подтверждение непатогенности. Проверка на отсутствие патогенных свойств GG-72 проведена на лабораторных стерильных белых мышах, которым вводили культуру GG-72. На протяжении стандартного периода времени испытаний не было выявлено никаких изменений как в поведении, так и в структуре внутренних органов мышей.По результатам оценки динамики роста и изменения рН среды были построены графики, представленные на рис. 3 и 4.    Рис. 3. Динамика изменения количества клеток GG-72, BGV-11 Рис. 4. Динамика изменения активной кислотности среды культивирования  Анализ полученных результатов показал, что штамм GG-72 способен активно накапливать био­массу. Менее чем за 12 часов роста количество кле­ток штамма достигало порядка lg 9 КОЕ/см3, что превышает нормируемые количества бифидобакте­рий lg 6 КОЕ/см3 в функциональных кисломолочных продуктах.По изменению кислотности среды (рис. 4) можно говорить, что штамм GG-72 обладает типичной для бифидобактерий динамикой понижения кислотности среды. Количество клеток бифидобактерий в среде на уровне lg 9 КОЕ/см3 и понижение pH среды ниже      5 ед. способно обеспечить повышение безопасности продуктов питания. Полученные данные динамики роста расширяют понимание процесса культивиро­вания изучаемого штамма бифидобактерий. Такая информация ценна для более качественного наращи­вания биомассы изучаемого штамма как в лабора­торных, так и в промышленных масштабах.Антагонистическая активность. Результаты исследований, представленные на рис. 5, свидетель­ствуют о проявлении выраженной антагонистиче­ской активности изученных штаммов по отношению к тест-культуре E. coli O157. Следует отметить, что новый штамм Bifidobacterium bifidum GG-72 обла­дает таким же выраженным действием на E. coli O157, как и штамм Bifidobacterium adolescentis BGV-11, эффективность которого подтверждена клиниче­скими испытаниями на животных и людях.Результаты совместного культивирования пато­генной тест-культуры Staph. aureus 209-P с моно­штаммами бифидобактерий GG-72, 771, BGV-11 представлены на рис. 6. В данном случае можно го­ворить о более выраженной антагонистической ак­тивности штамма GG-72: наблюдали снижение ко­личества Staph. aureus 209-P более чем на 4 порядка, в то время как штаммы 771, BGV-11 снижали коли­чество патогенного тест-микроорганизма более чем на 3 порядка.    Рис. 5. Снижение роста E. coli O157 штаммами GG-72, 771, BGV-11 Рис. 6. Снижение роста Staph. aureus 209-P штаммами GG-72, 771, BGV-11  Таким образом, анализ результатов выполненных исследований показал, что новый штамм Bifido-bacterium bifidum GG-72 обладает антагонистической активностью по отношению к патогенным тест-культурам E. coli O157 и Staph. aureus 209-P, а следовательно, способен проявлять функциональные свойства.Определение технологических свойств и показателей, косвенно характеризующих выживаемость клеток изучаемого штамма в желудочно-кишечном тракте. Результаты оценки технологических свойств штамма GG-72 представлены в табл. 1. Таблица 1  Рост штамма GG-72 в различных технологических условиях   Условия  ШтаммNaCl, %Фе-нол, %Желчь, %рН246,50,420405,57,28,3GG-72+––±±–+++771±––±±–±++BGV-11+±–±±±±++ Анализ полученных данных показал, что штамм GG-72 хорошо выдерживает изменение рН среды от 5,5 до 8,3 единиц; устойчив в питательной среде с добавлением поваренной соли в концентрации 2 %;некоторые клетки популяции штамма способны выживать в питательной среде с добавлением 0,4 % фенола и 20 % желчи. Результаты исследований нового штамма Bifidobacterium bifidum GG-72 позволяют сделать заключение о проявлении штаммом достаточно высокой способности к действию неблагоприятных факторов, которые возникают в желудочно-кишечном тракте организма человека.  Выводы1. Получен и идентифицирован новый штамм Bifidobacterium bifidum GG-72.2. Штамм GG-72 можно характеризовать как природный, безопасный, проявляющий антагонисти-ческую активность по отношению к патогенным микроорганизмам. 3. Экспериментально показана косвенная способ-ность штамма GG-72 выживать в условиях желудочно-кишечного тракта человека.4. Bifidobacterium bifidum GG-72 принят на национальное патентное депонирование во Всерос-сийскую коллекцию промышленных микроорга-низмов с присвоением номера АС-1884.5. Сходство показателей штамма GG-72 cо штаммом BGV-11 дает предпосылки к рассмотрению нового штамма GG-72 в качестве перспективного биологического агента, способного повышать биобезопасность продуктов питания и привносить иные ценные пробиотические свойства в продукты питания.