Введение Молочнокислые бактерии и бифидобактерии, как сообщается в литературе, являются пробиотиками с полезными для здоровья свойствами [3–6, 8, 10].В соответствии с данными рабочей группы Про-довольственной и сельскохозяйственной организации объединенных наций (ООН) [9] и Всемирной орга-низации здравоохранения (ВОЗ) [10] пробиотические бактерии определены как живые микроорганизмы, которые полезны при приеме внутрь в адекватных количествах.Монгольская культура питания отличается от за-падных культур, особенно в потреблении кисло-молочных продуктов. Молочные продукты занимали одно из ведущих мест в питании кочевых народов Монголии, для их изготовления употребляли молоко разных видов домашних животных (коров, овец, коз, яков, кобыл и верблюдиц). Национальные кисло-молочные продукты Монголии – ааруул, ээзгий и бяслаг – являются наиболее употребляемыми, но сообщений о составе их микрофлоры нами не об-наружено, в то время как о микробиологическом составе тарага, хоормога и айрага имеются данные в литературе. В Монголии и Внутренней Монголии (Китай) также проводятся исследования в данном направлении, но они пока очень малочисленны [7]. В Монголии для производства кисломолочных продук-тов применяют импортируемые типо­вые закваски из разных стран мира. Однако до настоящего времени в Монголии не организовано собственное произ-водство заквасок для национальных кисломолочных продуктов. В этой связи выделение и изучение свойств микрофлоры таких национальных кисло-молочных продуктов, как тараг, хоормог, ааруул, бяслаг, ээзгий, является актуальной задачей. Объекты и методы исследованийОбъектами исследований были тараг (идентичен йогурту), хоормог – кисломолочный продукт из вер-блюжьего молока, айраг – кисломолочный напиток из кобыльего молока, бяслаг (типа сыра) и другие продукты, полученные в частных хозяйствах. Всего было изучено 66 образцов традиционной монголь-ской молочной продукции (табл. 1), которые отобраны из трех регионов: Тов, Хубсугул и Дор-ноговь. В исследованиях применяли стандартные методы биохимических и микробиологических ис-следований, а также генетические методы, в част-ности 16S-рибосомальной ДНК.  Таблица 1 Названия исследованных национальных молочных продуктов, изготовленных из разного молочного сырья в регионах Тов, Хубсугул и Дорноговь Наимено-ваниерегионаМестностьПродуктыТараг и хоормогАйрагАаруулБяслагЭэзгийКо-роваКозаВер-блюдОвцаЯкКобылаКороваКороваКороваТовУлаанбаатар83   55 3ТовАлтанбулаг116 212312ХубсугулМурун8        ДорноговьСайншанд  6      Всего 2796217815  Результаты и их обсуждениеВыделение и идентификация штаммов молочно-кислых бактерий. Для предварительной идентифи-кации все колонии, выделенные с питательных сред MRS и GYP, окрашивали по Граму и тестировали на каталазную активность. Из образцов национальных молочных продуктов выделили 543 изолята, все они были грамположительными и каталазанегативными (табл. 2). Штаммы, которые были грампозитивными и каталазанегативными, отнесены к молочнокислым бактериям.  Tаблица 2 Количество выделенных штаммов из кисломолочных продуктов Название продуктаКоличество выделенных штаммов молочнокислых бактерийКоличество%Тараг и хоормог42077,3Айраг6712,3Ааруул417,6Бяслаг152,8 Большинство штаммов молочнокислых бактерий выделено из тарага и хоормога – 77,3 % и составляло 420 штаммов, из айрага – 12,3 % исоставляло 67 штаммов, из ааруула – 7,6 % и сос-тавляло 41 штамм, из бяслага – 2,7 % и составляло 15 штаммов. Штаммы, выделенные из тарага и хоормога, классифицированы на 17 видов с при-менением метода 16S-рибосомальной ДНК. Все штаммы, выделенные из айрага, классифицированы на 12 видов; из ааруула – на 10 видов; из бяслага –      на 5. Штаммы, выделенные из тарага, идентифициро-вали на основе 500 пар оснований цепи, начиная        с 5’ конца 16S-рибосомальной ДНК (16S rДНК). Полученные данные представлены в табл. 3.Большинство среди выделенных штаммов отне­сено к следующим таксономическим группам: Lacto-bacillus (L.) delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus fermentum, Streptococcus (Str.) thermophilus. Представленные результаты иденти-фикации штаммов микроорганизмов из продукта с одним названием, но полученного на основе молока разных сельскохозяйственных животных свидетель-ствуют и о разнообразном составе присутствующей в них микрофлоры. Это можно объяснить тем, что культура и получение монголь­ских молочных продуктов различны, а поэтому они могут включать потенциально необычные микроорганизмы. Резуль-таты проведенных исследований позволяют заклю-чить, что доминирующими видами молочнокислых бактерий в тараге являются L. delbrueckii ssp. bulga-ricus, L. helveticus, L. fermentum и S. thermophilus.  Таблица 3 Штаммы и количество LAB изолятов,выделенных из тарага  МолококоровакозаверблюдовцаякLactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus9141974Lactobacillus helveticus58810 1Lactobacillus fermentum271710 3Streptococcus thermophilus393 1 Enterococcus durans151 Lactococcus lactis ssp. lactis474 Lactobacillus pentosus615 Weissella confusa10 Lactobacillus kefiri6 1 Lactobacillus paracasei ssp. tolerans2 4 Lactobacillus plantarum1 4 Pediococcus parvulus5 Leuconostoc citreum122 Lactobacillus paracasei ssp. paracasei1 3 Enterococcus faecium2 1 Leuconostoc mesenteroides1 1 Weissella viridescens1    Всего270805488 Проверка выделенных штаммов на пробиоти-ческую активность. Выделенные штаммы молочно-кислых бактерий из монгольских молочных продук-тов были проверены на пробиотическую активность. Одной из важнейших характеристик, применяемых при отборе пробиотических штаммов, является их резистентность к желудочному соку и желчным кислотам. Выживаемость бактерий в искусственном желудочном соке анализировали путем проведения теста на толерантность к желчным кислотам путем выращивания в GYP бульоне, содержащем 0,2 % бычьей желчи.Результаты исследований показали, что из 543 ис-следованных штаммов только 126 росли в среде бульона с добавлением 0,25 % желчи, т.е. были толерантны к желчным кислотам. Далее эти штаммы были тестированы на толерантность к желудочному соку. Считали, что штаммы толерантны к желу-дочному соку, если после их инкубации в течение 3 ча-сов c 0,04 % пепсином (pH 3,0) количество клеток составляло не менее 7 log КОЕ/мл. Из 126 штаммов, толерантных к желчным кислотам, 114 были толерант-ны к желудочному соку (табл. 4). К важнейшей характеристической особенности пробиотических бактерий относят их адгезивную способность. Порогом адгезии считали, что коли-чество прикрепленных клеток к эпителию должно составлять 5,0×104 КОЕ/мл. 42 штамма, про­являя-ющих гомоферментативные свойства, были тести-рованы на адгезивность к Сасо-2 клеткам. Установ-лено, что 10 штаммов с числом колоний от 7,0×103 до 7,5×104 КОЕ/мл и штамм L. plantarum 05АМ23 имели наивысшие значения адгезии к Сасо-2 клеткам (табл. 4 и 5).   Таблица 4 Результаты изучения пробиотических свойств штаммов, выделенных из национальных фер­ментируемых молочных продуктов Монголии Наименование штаммовКоличествоВыживаемость в желчиТолерантность к низким рНГазообразование (–)Адгезия на Caco-2 клеткахLactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus1558220Lactobacillus helveticus1150   Lactobacillus fermentum7850500 Streptococcus thermophilus4350  Enterococcus durans170   Weissella confusa1616160 Lactococcus lactis ssp. lactis202220Lactobacillus buchneri7110 Lactobacillus kefiri100   Lactobacillus plantarum111111115Lactobacillus pentosus139990Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis212221Pediococcus parvulus55550Enterococcus faecium50   Weissella viridescens6660 Lactobacillus paracasei ssp. torelans65552Lactobacillus paracasei ssp. paracasei44442Lactobacillus sakei 22220Leuconostoc mesenteroides20   Leuconostoc citreum60   Leuconostoc garlicum10    5431251144210Таблица 5 Характеристика штаммов LAB, тестированных на пробиотическую активность №ШтаммыТолерант-ность к желчным кислотам (%)*Выживаемость при низких рН (log CFU/мл)**Адгезияна Caco-2клетках    (×103 CFU/мл)***ПродуктыМолокоАймакМестность05AM23L. plantarum97,08,175,0АйрагКобылаТовУлаанбаа-тар06Tca8L. plantarum88,98,27,0ТарагВерблюдДорноговьСайншанд06Tca19L. paracasei ssp. paracasei87,98,011,0ТарагВерблюдДорноговьСайншанд06Tca22L. paracasei ssp. paracasei92,68,012,0ТарагВерблюдДорноговьСайншанд06Tca39L. paracasei ssp. tolerans87,47,318,0ТарагВерблюдДорноговьСайншанд06Tca40L. plantarum85,47,713,0ТарагВерблюдДорноговьСайншанд06Tca43L. paracasei ssp. paracasei85,67,016,0ТарагВерблюдДорноговьСайншанд06CC2L. plantarum97,08,713,0АаруулКороваТовАлтанбу-лаг06CC3L. delbrueckii ssp. lactis83,08,527,0ТарагКороваTовАлтанбу-лаг06CC9L. plantarum92,68,08,0АаруулКороваТовАлтанбу-лаг* Процент выживших колоний в GYP бульоне, содержащем 0,2 % бычьей желчи по сравнению с контро­лем. ** Число выживших колоний LAB после обработки 0,04 % пепсином при pH 3,0 в течение 3 часов.*** Число выживших колоний LAB, адгезированных на Caco-2 клетках после инкубации. Таблица 6 Углеводный профиль штаммов LAB, выбранных в качестве пробиотиков №05AM2306Tca806Tca1906Tca2206Tca3906Tca4006Tca4306CC206CC306CC9Углеводы1122212131D-Arabinose––––––––––L-Arabinose––––––––––D-Ribose++++++++–+D-Xylose––––––––––L-Xylose––––––––––D-Galactose++++++++–+D-Glucose++++++++++D-Fructose++++++++++D-Mannose++++++++++L-Rhamnose––––––––––D-Mannitol++++++++–+D-Sorbitol++++++++–+Amygdalin++++++++–+Esculin++++++++–+Salicin++++++++–+D-Celibiose++++++++–+D-Maltose++++++++–+D-Lactose++++++++++D-Melibiose++–––+–+–+D-Sucrose++++++++–+D-Trehalose++++++++++D-Melezitose+++++–+––+D-Raffinose–––––+–+–+Gluconate++++++++–+Starch––––––––––Примечание: 1 – L. plantarum; 2 – L. paracasei ssp. paracasei; 3 – L. delbrueckii ssp. lactis; + позитивный; – негативный.  Известно, что молочные бактерии могут фер-ментировать углеводы с образованием преиму-щественно одного конечного продукта брожения, т.е. быть гомоферментативными, и с образованием нескольких ко­нечных продуктов брожения, т.е. быть гетероферментативными. Данная характеристика очень важна для штаммов молочнокислых бактерий, поскольку позволяет определить целесообразность его применения в со­ставе закваски для конкретного молочного продукта. Исследования показали, что из 114 штаммов, толерантных к желчным кислотам и желудочному соку, 42 штамма проявляли гомофер-ментные свойства, т.е. их можно применять для производства некоторых видов кисломолочных продуктов, в частности йогуртов. Выделенные штаммы с высокой адгезивной спо-собностью были проанализированы по способности к сбраживанию углеводов. Полученные данные приведены в табл. 6.Результаты идентификации изучаемых штаммов молочнокислых бактерий, за исключением 06TСа39 штамма, совпадали с результатами 16S-рибосо-мальной ДНК. Для определения возможности применения вновь выделяемых штаммов молочнокислых бактерий в технологии молочных продуктов следует очень тща-тельно проверять все их характеристики. Интерес-ным пред­ставлялось определение гомологии между штаммами молочнокислых бактерий, отнесенных к одному виду, выделенных из одинаковых продуктов и одного места происхождения. Для этого был проведен RAPD-ПЦР анализ между следующими LAB штаммами: L. plantarum 06Tca8 – L. plantarum 06Tca40, L. plantarum 06CC2 – L. plantarum 06CC9, L. paracasei spp. paracasei 06Tca19 – L. paracasei spp. paracasei 06Tca22 – L. paracasei spp. paracasei 06Tca43. Анализ полученных результатов с при-менением этого метода позволяет сделать заключе­ние, что штаммы 06Tca8 – 06Tca40, 06CC2 – 06CC9 и 06Tca19 – 06Tca22 – 06Tca43 могут представлять индивидуальные изоляты (рис. 1).Результаты исследований показали, что штаммы 06Tca8 и 06Tca40, выделенные из хоормога, изготовленного из верблюжьего молока местности Сайншанд Дорноговь региона, и штаммы 06CC2 и 06CC9, выделенные из тарага, изготовленного из коровьего молока местности Алтанбулаг Тов аймака, относятся к L. plantarum. Штаммы 06ТСА19, 06Tca22 и 06Tca43, выделенные из хоормога, изго-товленного из верблюжьего молока местности Сайншанд Дорноговь региона, относятся к L. paraca-sei ssp. paracasei.Основной и полезной микрофлорой в типовых йогуртах является L. delbrueckii ssp. bulgaricus и         S. thermophilus. Технология производства тарага идентична технологии производства йогурта. На основе результатов проведенных исследований можно заключить, что доминирующими видами молочно-кислых бактерий в тараге являются L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. helveticus, L. fermentum и S. thermophilus. Поэтому тараг и йогурт можно рассматривать как одиноковый тип молочного продукта. Поскольку культура получения молочных продуктов в Монголии отличается от производства в других странах, они могут включать нехарактерные для йогурта микроорганизмы.          а   б Рис. 1. Профили семи изолятов молочнокислых бактерий при проведении ПЦР со случайной ампли-фикацией: а – дорожка 1, 2, 5 и 6 – использован праймер р7,  дорожка 3, 4, 7 и 8 – использован праймер р11, дорожка М – маркер ДНК, дорожка 1 и 3 – 06Tca8, дорожка 2 и 4 – 06Tca40, дорожка 5 и 7 – 06CC2, дорожка 6 и 8 – 06CC9; б – дорожка 1, 2 и 3 – использован праймер АТ41, дорожка 4, 5 и 6 – использован праймер ВТ05, дорожка М – маркер ДНК, дорожка 1 и 4 – 06ТСА19, дорожка 2 и 5 – 06Tca22, дорожка 3 и 6 – 06Tca43 В результате проведенных исследований выявлено, что доминирующими видами молочно-кислых бактерий в айраге были L. helveticus, L. delb-rueckii ssp. lactis, L. fermentum. Полученные данные отличаются от сообщенных ранее в работе [4]. Используя молекулярно-биологические методы, Watanabe et al. идентифицировали из айрага в основ-ном L. kefiranofaciens, которые не были обнаружены в исследованных нами образцах. В то же время обнаруженные и идентифицированные нами              L. helveticus, L. delbrueckii ssp. lactis, L. fermentum не были обнаружены авторами работы [4]. Такие раз-личные результаты свидетельствуют о видовом разнообразии микрофлоры продукта айраг, ее воз-можном количественном и качественном изменении и необходимости продолжения исследований. Нами обнаружено, что в аарууле присутствуют гомофер-ментативные молочнокислые бактерии L. helveticus и L. delbrueckii ssp. lactis, а также гетерофермента­тивные молочнокислые бактерии L. fermentum,         L. buchnerii и W. сonfuse.В бяслаге доминировали L. delbrueckii ssp. lactis и L. lactis spp. lactis. Есть вероятность того, что гетеро-ферментативные молочнокислые бактерии в аарууле могли быть внесены из внешней среды, так как по традиционной технологии ааруул изготавливают кипячением тарага и последующей сушкой на солнце.Ээзгий изготавливают кипячением и упариванием на медленном огне створоженного молока с пос-ледующим дроблением сгустка и сушкой на солнце. Вероятно, из-за продолжительного высокотемпера-турного технологического процесса приготовления в ээзгий молочнокислых бактерий не обнаружили. Установлено, что 6 из 10 штаммов молочно-кислых бактерий, выделенных из хоормога, облада-ют пробиотической активностью. Из 54 молочнокис-лых бактерий, идентифицированных как L. plantarum или L. paracasei ssp., 10 выделены из хоормога, изготовленного из верблюжьего молока.  ВыводыВ результате проведенных исследований микро-флоры национальных молочных продуктов, отобран-ных в 3 регионах Монголии, удалось выделить иидентифицировать 10 гомоферментативных про-биотических штаммов молочнокислых бактерий. Они были идентифицированы и классифицированы как L. plantarum, L. paracasei spp. Выделено большое количество гетероферментативных штаммов L. fer-mentum, толерантных к желчным солям и желу-дочному соку. Штаммы L. fermentum, которые имели сильную толерантность к желудочному соку и желчным солям, были также найдены в тради-ционных кенийских ферментированных молочных продуктах [11]. Таким образом, выделенные и идентифициро-ванные штаммы молочнокислых бактерий, обладаю-щие пробиотическими свойствами, можно рекомен­довать для включения в коллекцию микроорганиз­мов Монголии и создания заквасок, применяемых в производстве кисломолочных продуктов.