Введение Основной проблемой при производстве мицелия съедобных грибов является создание оптимальных физиологических условий культивирования для достижения высокого и стабильного выхода биомассы [1, 12]. Прежде всего это касается решения проблем высокой скорости роста мицелия и продуктивности. Одним из способов увеличения выхода высококачественного мицелия может быть введение витаминов на разных этапах онтогенеза грибов [2, 3]. Многие авторы в своих работах показали стимулирующую роль витаминов [3, 6, 7]. По их мнению, они эффективны в очень малых дозах и имеют специфическое действие на определенные этапы обмена веществ [7, 9, 10, 11]. Сапротрофные грибы по отношению к витаминам разделяют на две группы: витаминоауксогетеротрофные, у которых отсутствует способность синтезировать необходимые для них витамины, и витаминоауксотрофные, обладающие способностью синтезировать требуемые витамины при росте в питательной среде [2]. При этом большинство сапротрофных грибов относятся к витаминоауксотрофной группе. Однако такое распределение на группы носит условный характер, так как при добавлении в питательную среду витаминов усиливается рост мицелия и ауксотрофных грибов [3-6]. Витамины имеют большое значение для онтогенеза грибов, а именно: входят в состав биологически активных органических соединений; участвуют в стабилизации коллоидных частиц и макромолекул, создавая определенные ионные концентрации; участвуют в каталитических реакциях, входя в состав отдельных ферментов [2]. Для сапротрофных грибов витамины требуются в очень низких концентрациях (0,0001 до 1 мг/мл). Потребность грибов в витаминах может ограничиваться всего одним или может быть комплексной, включающей до 5-7 различных витаминов. Иногда витамины заменяются их предшественниками (например, тиамин - пиримидином и тиазолом). У некоторых видов грибов существуют одинаковые потребности в витаминах, к примеру, многие виды нуждаются в полной молекуле тиамина. В то же время у некоторых видов наблюдается полная ауксотрофность. Особенно тесной связи между потребностями грибов в витаминах и их экологией не наблюдается. Ауксогетеротрофность может быть связана с паразитизмом, симбиозмом или антропогенным фактором [5]. Грибы больше всего нуждаются в водорастворимых витаминах группы B и особенно в тиамине. Потребность грибов в тиамине впервые обнаружена Шопфером и Бургеффом в 1934 г. Потребность в тиамине встречается у очень многих сапротрофных грибов. Избыток тиамина в питательной среде вызывает ингибирование роста грибов, что связано с накоплением в культуре грибов этилового спирта в результате декарбоксилирования пирувата. При недостатке тиамина в среде нуждающихся в нем грибов наблюдается избыточное накопление в ней пирувата. Помимо тиамина, некоторые сапротрофные грибы нуждаются в рибофлавине, никотиновой кислоте и витамине С [2]. Рибофлавин состоит из изоаллоксазинового ядра и спирта рибитола - производного рибозы. Этот витамин является второй простетической группой ряда дегидрогеназ, где активной группой является флавинаденинмононуклеотид; принимает участие в первом этапе пути метаболизма гексоз через гексозомонофосфат, окисляя глюконовую кислоту и глюкозу [6]. Рибофлавин хорошо синтезируется некоторыми сапротрофными грибами, вследствие чего они могут служить источниками для промышленного получения этого витамина [3]. Никотиновая кислота представляет собой производное пиридина с замещенным карбоксильной группой водородом по атому C3 [11], участвует практически во всех реакциях дегидрогенизации и гидрогенизации; принимает участие в каталитических реакциях ферментов, восстанавливающих нитраты при образовании макроэргических фосфатов в процессе окислительного фосфорилирования [10]. Витамин С имеет структуру, сходную с кетосахарами, и его функции связаны со способностью легко окисляться в дегидроаскорбиновую кислоту. Некоторые сапротрофные грибы хорошо синтезируют аскорбиновую кислоту по ксилулозному пути углеводного обмена через промежуточные стадии гулоновой и глюкуроновой кислот. В настоящее время биологическая роль витаминов еще мало изучена на базидиомицетах, но, судя по имеющимся литературным данным, она весьма значительна [2, 3]. В связи с этим целесообразно исследовать влияние витаминов на процесс получения мицелия съедобных грибов. Целью работы являлось изучение влияния витаминов на рост и развитие мицелия Armillaria mellea (Vahl: Fr.) P. Kumm и Lentinula edodes (Berk.) Pegler при культивировании в стационарных условиях. Объекты и методы исследований Объектами исследования были штамм L. edodes F-1000, приобретенный через интернет-магазин (http://www.stolbovo.ru), и чистая культура гриба A. mellea, выделенная из плодовых тел, собранных с пней березы повислой (Betula pendula) в естественных местообитаниях Алтайского края. Идентификация вида A. mellea осуществлялась по определителю грибов [8]. Выделение A. mellea в чистую культуру проводилось из тканей свежесобранных грибов по методике, описанной А.С. Бухало [5]. В настоящее время подана заявка на идентификацию штамма. Результаты исследований будут приведены в последующих публикациях. Выращивание культур грибов осуществляли в чашках Петри методом поверхностного культивирования на сусло-агаре при температуре 28 °C до полного зарастания мицелием питательной среды. Хранили культуры на скошенной сусло-агаровой среде в пробирках при температуре (4±1) °C. Биомассу мицелия получали в стационарных условиях на жидкой питательной среде состава: глюкоза - 1,0 %, пептон основной сухой - 0,5 %, КН2РО4 - 1,1 %, МgSO4×7Н2О - 0,1 %, Н2О (дистил.) - 97,3 %. Для культивирования использовались колбы емкостью 500 мл с объемом среды 250 мл. Стерилизацию раствора пептона и солей осуществляли автоклавированием при избыточном давлении 0,12 МПа, раствор глюкозы при 0,05 МПа в течение 30 мин. Для получения инокулята выращенный в чашках Петри на сусло-агаре мицелий вносили в колбы со стерильной жидкой средой (диаметр колоний 10 мм) и культивировали в стационарных условиях. Выращенный мицелий стерильно гомогенизировали и вносили в колбы для культивирования, объемная доля составляла 10 %. При получении мицелия в стационарных условиях использовали термостат (ТС-80М-20). Биомассу мицелия собирали и высушивали в сушильном шкафу (СНОЛ-3,5) при температуре 55 °С до постоянной массы и измельчали. Для изучения влияния витаминов на рост мицелия культур грибов A. mellea и L. edodes использовали: рибофлавин (ЛСР-002944/07), тиамин (ЛСР-002679/07), никотиновую кислоту (ЛСР-015076/01), витамин C (ЛСР-000781/08) и смесь четырех витаминов с концентрациями в глюкозо-пептонной среде (ГПС) 0,15; 0,20; 0,40; 0,60 и 0,80 мг/мл. Для получения мицелия в стационарных условиях использовали термостат (ТС-80М-20). Накопление биомассы оценивалось по воздушно-сухой массе (10 % влажность) мицелия. Вычисление скорости линейного роста колонии проводили по формуле V = (D - d)/t, где D - диаметр колонии, мм; d - диаметр инокуляционного блока, мм; t - продолжительность культивирования, сутки [7]. Определение редуцирующих сахаров проводили по ГОСТ 12575-2001. Процесс роста мицелия контролировали по интенсивности потребления сахаров в среде. Накопление биомассы прекращали при снижении концентрации редуцирующих веществ до 0,4 % и менее. Эксперимент проводили в 3-кратной повторности. Статистическая обработка данных проводилась с использованием компьютерной программы Microsoft Excel 2010. Результаты и их обсуждение Одним из основных показателей, определяющих экономическую эффективность той или иной биотехнологии, является продолжительность процесса получения целевого продукта [11, 12]. Поэтому при изучении влияния витаминов на рост мицелия важным этапом является изучение динамики его накопления при культивировании на жидкой среде. На ГПС увеличение биомассы мицелия A. mellea и L. edodes в зависимости от времени культивирования отображается S-образными кривыми, что характерно для роста базидиальных грибов [10]. Анализ полученных зависимостей позволяет выделить у видов A. mellea и L. edodes пять фаз роста. I фаза (лаг-фаза) характеризуется самым низким приростом биомассы. Известно, что в этот период развития происходит настройка ферментной системы организма на компоненты питательной среды [12]. Длительность лаг-фазы у A. mellea составляет 4 суток, тогда как у L. edodes 2 суток. Скорость роста мицелия возрастает, и наступает II - фаза роста (фаза ускорения), период которой у видов A. mellea и L. edodes на ГПС длится 2 суток. Затем рост мицелия переходит в III - фазу экспоненциального роста, в которой жизненная активность мицелия A. mellea и L. edodes становится заметно выше при сравнении с другими фазами роста. Продолжительность III фазы у A. mellea составляет 20 суток, в то время как у L. edodes - 6 суток. Считается, что в этой фазе наблюдается максимальная скорость роста мицелия [11]. После экспоненциальной фазы рост мицелия переходит в IV - фазу замедления. Известно, что уменьшение скорости роста мицелия связано с действием лимитирующих факторов среды - исчерпание питательных веществ и накопление метаболитов в замкнутой системе [12]. При наступлении V - фазы стационарного роста нарастание биомассы практически прекращается (рис. 1). Максимальный выход мицелия у A. mellea был получен на 28 сутки и составлял 26,48 г/л, у L. edodes на 12 сутки культивирования - 8,00 г/л. Наблюдения за ростом культур A. mellea и L. edodes в присутствии витаминов позволили получить следующие результаты, представленные в табл. 1. Таблица 1 Количество биомассы и среднесуточная скорость роста мицелия видов A. mellea и L. edodes при внесении в ГПС витаминов № Концентрации, мг/мл Количество биомассы, г/л % к контролю по биомассе мицелия Скорость роста, мм/сут. % к контролю по скорости роста A. mellea L. edodes A. mellea L. edodes Рибофлавин 1 0,15 26,55 9,55 100,3 119,4 2,95 7,12 118,0 100,3 2 0,20 28,30 10,10 106,9 126,3 3,64 7,20 145,6 101,4 3 0,40 27,10 9,50 102,3 118,8 3,20 7,25 128,0 102,1 4 0,60 24,00 8,20 90,6 102,5 2,94 7,20 117,6 101,4 5 0,80 22,45 7,86 84,7 98,2 2,65 7,18 106,0 101,1 6 Контроль 26,48 8,00 100 100 2,50 7,10 100 100 Тиамин 1 0,15 26,42 8,94 99,7 111,7 3,00 7,10 120,0 100,0 2 0,20 26,94 10,60 101,7 132,5 3,60 7,15 144,0 100,7 3 0,40 26,72 10,80 100,9 135,0 3,10 7,20 124,0 101,4 4 0,60 21,10 9,00 79,6 112,5 2,86 7,15 114,4 100,7 5 0,80 21,00 8,20 79,3 102,5 2,60 7,10 104,0 100,0 6 Контроль 26,48 8,00 100 100 2,50 7,10 100 100 Никотиновая кислота 1 0,15 22,40 6,10 84,5 76,2 2,60 7,10 104,0 100,0 2 0,20 25,10 6,20 94,7 77,5 2,70 7,17 108,0 100,9 3 0,40 24,80 6,18 93,6 77,2 2,76 7,15 110,4 100,7 4 0,60 19,00 5,94 71,7 74,2 2,40 7,12 96,0 100,3 5 0,80 18,60 5,90 70,2 73,7 2,40 7,05 96,0 98,9 6 Контроль 26,48 8,00 100 100 2,50 7,10 100 100 Витамин C 1 0,15 21,50 6,90 81,2 86,2 2,46 7,12 98,40 100,2 2 0,20 22,60 6,94 85,3 86,7 2,54 7,16 101,6 100,8 3 0,40 23,20 6,80 87,6 85,0 2,50 7,10 100,0 100,0 4 0,60 21,46 6,74 81,0 84,2 2,30 7,06 92,00 99,40 5 0,80 18,40 6,65 69,5 83,1 2,20 7,02 88,00 98,87 6 Контроль 26,48 8,00 100 100 2,50 7,10 100 100 Смесь витаминов 1 0,15 26,10 6,48 98,5 81,0 2,75 7,12 110,4 100,2 2 0,20 27,10 6,54 102,3 81,7 2,90 7,17 116,0 100,9 3 0,40 26,20 6,40 98,9 80,00 2,80 7,20 112,0 101,4 4 0,60 23,00 6,35 86,8 79,4 2,55 7,10 102,0 100,0 5 0,80 22,90 6,20 86,5 77,5 2,50 7,10 100,0 100,0 6 Контроль 26,48 8,00 100 100 2,50 7,10 100 100 Примечание: относительная погрешность для биомассы мицелия ±0,2 г/л; для скорости роста ±0,1 мм/сут Из данных табл. 1 видно, что максимальная биомасса мицелия A. mellea на ГПС с рибофлавином в концентрации 0,20 мг/мл и составляла 28,30 г/л уже через 20 суток культивирования, в то время как примерно такое же значение биомассы в контроле достигалось лишь через 28 суток. Стимулирующий эффект в той же концентрации наблюдался с добавлением в ГПС тиамина и смеси витаминов, биомасса мицелия A. mellea при сравнении с контролем также различалась незначительно и составила 26,94 и 27,10 г/л через 20 и 24 суток соответственно (рис. 1). Характер роста мицелия A. mellea с добавлением этих витаминов существенно отличается от контроля сокращением экспоненциальной фазы роста. Добавление в ГПС никотиновой кислоты и витамина C с концентрациями 0,15; 0,20; 0,40; 0,60 и 0,80 мг/мл, а также рибофлавина и тиамина с концентрациями свыше 0,60 мг/мл вызывало ингибирование роста мицелия по отношению к контролю. Рис. 1. Динамика накопления биомассы мицелия A. mellea на ГПС с добавлением витаминов: I - лаг-фаза; II - фаза ускорения; III - экспоненциальная фаза; IV - фаза замедления; V - стационарная фаза Использование рибофлавина и тиамина с концентрацией 0,20 мг/мл в ГПС позволяет увеличить среднесуточную скорость роста в сравнении с контролем в 1,44-1,46 раза соответственно (рис. 2) и достичь стационарной фазы роста на 8 суток раньше. Рис. 2. Среднесуточная скорость роста культуры A. mellea на ГПС с добавлением витаминов При выборе витаминов для культивирования L. edodes также следует отдавать предпочтение рибофлавину (0,20 мг/мл) и тиамину (0,40 мг/мл) (рис. 3), увеличение биомассы мицелия в сравнении с контролем в 1,26-1,35 раза соответствен-но. Показано, что накопление биомассы на среде с рибофлавином не уступает таковому на среде с тиамином. По длительности культивирования и достижения стационарной фазы роста существенных различий в сравнении с контролем не обнаружено. Время культивирования в опытных и в контрольном вариантах составляло 10 суток. Биомасса мицелия, полученная на ГПС с никотиновой кислотой, витамином C и смесью витаминов в концентрациях 0,15; 0,20; 0,40; 0,60 и 0,80 мг/мл была ниже, чем в контроле (табл. 1). Среднесуточная скорость роста мицелия L. edodes с добавлением в ГПС этих витаминов мало отличалась от контроля (рис. 4). Рис. 3. Динамика накопления биомассы мицелия L. edodes на ГПС с добавлением витаминов: I - лаг-фаза; II - фаза ускорения; III - экспоненциальная фаза; IV - фаза замедления; V - стационарная фаза Рис. 4. Среднесуточная скорость роста культуры L. edodes на ГПС с добавлением витаминов Таким образом, при сравнении данных, полученных на контрольной и витаминизированных средах, было установлено как положительное, так и отрицательное влияние добавления витаминов в концентрациях 0,15; 0,20; 0,40; 0,60 и 0,80 мг/мл в ГПС на скорость роста и развития мицелия A. mellea и L. edodes. Выводы 1. Определены кинетические и продукционные показатели выращивания биомассы мицелия A. mellea и L. edodes на ГПС с добавлением витаминов в стационарных условиях. 2. Установлено, что рибофлавин и тиамин оказывают стимулирующее действие на интенсификацию ростовых процессов у мицелия A. mellea и L. edodes. При использовании оптимальной концентрации этих витаминов (0,20 мг/мл) достигалось увеличение среднесуточной скорости роста мицелия A. mellea в 1,44-1,46 раза. 3. Никотиновая кислота, витамин С и смесь витаминов не оказывали существенного влияния на рост A. mellea и L. edodes. 4. Максимальное накопление биомассы A. mellea было отмечено на среде с рибофлавином (0,20 мг/мл) и составляло 28,30 г/л через 20 суток культивирования. 5. Наибольшая биомасса у L. edodes наблюдалась на ГПС с тиамином (0,30 мг/мл) и составляла 10,80 г/л через 10 суток культивирования.