Введение Вторичные метаболиты имеют существенное значение для развития растений. Из класса фенольных соединений в большей мере известны: простейшие фенольные соединения, оксибензойные кислоты, фенилпропаноиды и флавоноиды. Они участвуют во многих процессах роста и развития растений. Например, в пигментации, в сигнальных и репродуктивных функциях. Есть предположения, что они могут регулировать клеточное деление. Фенольные соединения защищают растения от различных неблагоприятных факторов окружающей среды [1, 2]. В клетках животных и человека данные соединения не синтезируются. Их присутствие в тканях зависит от потребления в пищу растительных продуктов. Доказано, что смертность от инфаркта миокарда, онкологических и ряда других заболеваний характеризуется обратной корреляцией с потреблением флавоноидов [2–5]. Пищевые волокна дифференцированно влияют на выработку фенольных кислот из рутина в модели ферментации in vitro микробиоты кишечника человека. Доказано, что полифенолы усваиваются вместе с пищевыми волокнами. Они оба катаболизируются кишечной микробиотой и могут влиять на нее. Однако взаимодействие между ними и воздействие на их результирующие микробные продукты в настоящее время изучено не в полной мере. Взаимодействие между волокном и фенолами изменяет производство фенольных кислот и может стать ключевым фактором в повышении пользы для здоровья человека [6]. Ассоциация привычного потребления кофе с более низким риском заболеваний, таких как сахарный диабет 2 типа, хронические заболевания печени, некоторые виды рака или снижение смертности, была подтверждена в проспективных когортных исследованиях во многих регионах мира. Молекулярный механизм до сих пор не выяснен. Радикально-очищающая и противовоспалительная активность кофейных компонентов слишком слаба, чтобы объяснить такие эффекты. H. Kolb с соавторами утверждают, что кофе как растительная пища обладает полезными свойствами овощей и фруктов [7]. Недавние исследования выявили механизм укрепления здоровья общий для кофе, овощей и фруктов. Это активация адаптивного клеточного ответа, характеризующегося повышением регуляции белков, участвующих в защите клеток, в частности антиоксидантных, детоксицирующих и восстанавливающих ферментов. Ключом к этому ответу является активация системы Nrf2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor-2) фенольными фитохимическими веществами, которая индуцирует экспрессию генов клеточной защиты. Кофе играет доминирующую роль в этом отношении, поскольку является основным диетическим источником фенольных кислот и полифенолов в развитых странах мира. Поддерживающим действием может быть модуляция микробиоты кишечника непереваренными пребиотическими компонентами кофе, но имеющиеся данные все еще скудны. Исследователи пришли к выводу, что кофе использует те же пути укрепления здоровья, что и другие овощи и фрукты. Кофейные зерна можно рассматривать как здоровую растительную пищу и основного поставщика пищевых фенольных фитохимикатов [7]. Метаболомика – это мощный инструмент для исследования взаимодействий между питанием, питательными веществами и метаболизмом человека. Ecklonia cava – съедобная коричневая водоросль, которая встречается в Корее и Японии и содержит уникальные полифенолы, называемые флоротанинами. В исследованиях метаболомного профилирования J. Kim с соавторами показано, что уровни рибофлавина, урокановой кислоты, 5-гидрокси-6-метоксииндола глюкуронида и гуанидино валериановой кислоты были значительно повышены в группе приема сеаполинола по сравнению с группой плацебо [8]. Для выявления связи между уровнями метаболитов и клиническими характеристиками, связанными с жировыми отложениями, был проведен корреляционный анализ. Среди метаболитов, концентрация которых изменялась в группе потребления сеаполинола, рибофлавин был связан с индексом массы тела, массой тела, жировой массой и процентом жира в организме. Эти данные свидетельствуют о том, что снижение жировых отложений, вызванное приемом сеаполинола, связано с усилением антиоксидантного эффекта рибофлавина [8]. Ученые стали активно изучать родиолу розовую (Rhodiola rosea L.) с конца 50-х начала 60-х гг. прошлого столетия. В результате многолетних исследований установлены противовоспалительные, иммуномодулирующие, антистрессовые, антиокси- дантные, адаптогенные и другие положительные свойства данного вида [9, 10, 14]. Наиболее известным фенолоспиртом родиолы розовой является n-оксифенилэтанол – агликон гликозида салидрозида. Он является активным действующим веществом. В корневищах родиолы розовой накапливается достаточное количество салидрозидов [11]. Они оказывают противовоспалительное воздействие через производство цитокинов. Также предупреждают поражение клеток внутренних органов при гипоксии и ишемии и используются в качестве антиастматического средства [11]. Вещества группы фенилпропаноидов родиолы розовой (розавин, розарин, розин) имеют тонизирующий, ноотропный и седативный эффект при использовании в лечебных целях [9, 13]. Флавоны трицина, содержащиеся в наземной части родиолы розовой, могут блокировать свободные радикалы и положительно влиять на восстановление внутриклеточной структуры, замедлять процессы старения. Их полезно принимать в зоне радиоактивного излучения [2, 9]. Тирозол активно применяется для лечения фибрилляции предсердий при субклиническом тиреотоксикозе. Он приводит к уменьшению объема щитовидной железы, увеличивает уровень тиреотропного гормона, необходимого для оптимизации ее функций [13]. Астрагалин как сильный антиоксидант может купировать воспалительные процессы в организме, ингибировать рост злокачественных опухолей, восстанавливать поврежденные клетки головного мозга, очищать кровеносные сосуды и укреплять костную ткань. Следовательно, надземная часть родиолы розовой обладает совсем иными, но также уникальными свойствами, и может быть пригодна для приготовления различных напитков для профилактики и предупреждения сердечно- сосудистых заболеваний и онкологии [9]. В последние годы активно развиваются исследования по фотодинамической терапии [15, 16]. Они основаны на использовании двух групп пигментов: хлорофиллов и каротиноидов. Их производные могут проявлять антибактериальные, антиоксидантные и даже противораковые свойства. По данным института питания, уровень β-каротина в плазме крови у большинства населения нашей страны снижен в 2 раза по сравнению с населением зарубежных стран. Это приводит к риску развития разных форм рака. Так, ученые подтвердили ингибирование опухоли, а при удвоении дозы – полную гибель клеток, при введении β-каратина в дозе 6,25 мг/л [17]. Пополнить фонд витаминов в организме можно путем введения в рацион овощей и фруктов ярко-желтого и оранжевого цвета 396 Sergeeva I.Yu. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 3, pp. 393–403 (морковь, картофель с желтой и оранжевой окраской мякоти, абрикосы, некоторые виды дынь и тыквы), которые содержат около 80 % провитамина А в форме β-каротина. Витамин А участвует в синтезе стероидных гормонов (в том числе прогестерона), сперматогенезе, является антагонистом гормона щитовидной железы – тироксина [17]. Следовательно, в практике пищевых биотехнологий характеристика фотосинтетического потенциала растений, планируемых для введения в новый функциональный продукт, весьма актуальна. Объекты и методы исследования Объектами исследований стали три интродуциро- ванные в Кузбасс эколого-географически отдаленные популяции родиолы розовой (Rhodiola rosea L.): из Кузнецкого Алатау, Горного Алтая и Тункинских гольцов Бурятии. В 2018 г. корневища каждого растения расчеренкованы на одинаковые по массе доли (40–42 г) и помещены в питомник лекарственных растений. Определение морфометрических показателей растений. Линейные параметры побегов и листьев у родиолы розовой измеряли штангенциркулем. Определение фотосинтетических пигментов. Содержание пигментов в надземной биомассе растений осуществляли с использованием спектро- фотометра марки Jenway 6305 UV/VIS по методике, изложенной в [18]. Определение фенольных соединений. Определе- ние биологически активных веществ в биомассе родиолы розовой осуществляли методами высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) и тонкослойной (ТСХ) хроматографии. Подготовку проб и идентификацию веществ проводили по методике, описанной в [18]. Количественный анализ исследуемых вторичных метаболитов (флавонов) определяли с помощью калибровочных кривых, построенных в диапазоне концентраций 1,9–235 мкг/мл [20, 21]. Статистическая обработка результатов исследования. Все эксперименты проведены в трех-четырех кратной повторности. Данные представлены по среднему значению показателей и стандартному отклонению. Статистический анализ результатов выполнен с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием програм- много обеспечения Statistica 6.0. Результаты и их обсуждение Идентифицированные биологически активные вещества в корневищах с корнями в популяции родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) Горного Алтая представлены на рисунке 1 и в таблице 1. Хроматографический профиль отражает превали- рующее количество салидрозида (пик 18). На 20,4 % и 63,6 % меньше содержание розеина и галловой кислоты. Малое количество розавина, который отвечает за антифунгицидные, антимикробные, Рисунок 1. Хроматограмма этанольного извлечения фенолов из корневища и корней родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) в популяции Горного Алтая Figure 1. Chromatogram of ethanol extraction of phenols from the rhizome and roots of Rhodiola rosea L. (Gorny Altai) Таблица 1. Содержание фенольных соединений в корневищах и корнях родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) из популяции Горного Алтая Table 1. Content of phenolic compounds in the rhizomes and roots of Rhodiola rosea L. (Gorny Altai) Компонент Время удерживания, сек Номер пика хроматограммы Количественное содержание, мг/г Триандрин 497,64 4 4,85 ± 0,98 Гербацетин 777,66 6 0,42 ± 0,05 Галловая кислота 892,92 7 10,26 ± 2,31 Розеин 1080,60 8 20,45 ± 3,46 Дафнетицин 1158,42 9 13,8 ± 2,30 Плантамайозид 1284,60 10 2,74 ± 0,25 Розарин 1303,68 11 2,47 ± 0,25 Сирингин 1394,00 12 4,86 ± 0,86 Кемпферол 1463,00 13 2,20 ± 0,23 Розавин 1516,00 14 1,63 ± 0,16 Гербацитин 1661,19 16 1,13 ± 0,12 Салидрозид 2205,12 18 28,16 ± 2,27 397 Сергеева И. Ю. Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 3 С. 393–403 антиоксидантные и другие функции. Из 12 идентифи- цированных БАВ от 5 до 10 % в общем объеме занимают триандрин, розарин и сирингин, более 10 % – дафнетицин, розеин, галловая кислота и салидрозид. В популяции из Кузнецкого Алатау выделено 5 выраженных пиков на хроматограмме (рис. 2). Они соответствуют таким важным для медицинского и пищевого использования биологически активным веществам, как розавин, салидрозид, розин, розарин и метилгаллат (табл. 2). Полученные результаты свидетельствуют о существенном накоплении розовина в корневищах с корнями исследуемой популяции. Его количествен- ное содержание находится на уровне 37 % от общего числа идентифицированных фенолов. Существенную долю (32 %) в структуре БАВ родиолы розовой из популяции Кузнецкого Алатау занимает салидрозид. На такие важные компоненты, как розарин, розин и метилгаллат, приходится около 1/3 от общего объема. В исследуемом виде родиолы розовой самого географически удаленного местообитания (Тункинские хребты, Бурятия) наблюдается схожий с предыдущим образцом растения состав фитохимических компонентов как по численности, так и по фактическим значениям в отношении некоторых БАВ (рис. 3, табл. 3). Показано, что почти половина от суммы идентифицированных биологически активных веществ родиолы розовой данной популяции приходится на долю метилгаллата. В корневищах с корнями установлено значительное содержание розавина и коричного альдегида. Меньше всего Рисунок 2. Хроматограмма этанольного извлечения фенолов из корневища и корней родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) в популяции Кузнецкого Алатау Figure 2. Chromatogram of ethanol extraction of phenols from the rhizome and roots of Rhodiola rosea L. (Kuznetsk Alatau) Таблица 2. Содержание фенольных соединений в корневищах и корнях родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) из популяции Кузнецкого Алатау Table 2. Content of phenolic compounds in the rhizomes and roots of Rhodiola rosea L. (Kuznetsk Alatau) Компонент Время удерживания, сек Номер пика хроматограммы Количественное содержание, мг/г Розавин 721,80 1 16,89 ± 2,11 Салидрозид 354,12 3 14,35 ± 2,52 Розин 780,23 2 5,04 ± 0,93 Розарин 1331,65 4 2,01 ± 0,37 Метилгаллат 732,25 5 6,80 ± 1,05 Рисунок 3. Хроматограмма этанольного извлечения фенолов из корневища и корней родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) в популяции Тункинских хребтов Бурятии Figure 3. Chromatogram of ethanol extraction of phenols from the rhizome and roots of Rhodiola rosea L. (Tunka ridge, Buryatia) Таблица 3. Содержание фенольных соединений в корневищах и корнях родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) из популяции Тункинских хребтов Бурятии Table 3. Content of phenolic compounds in the rhizomes and roots of Rhodiola rosea L (Tunka ridge, Buryatia) Компонент Время удержания, сек Номер пика хромотограммы Количественное содержание, мг/г Метилгаллат 97,2 1 39,00 ± 1,05 Салидрозид 133,8 11 1,82 ± 2,52 Коричный альдегид 318,6 5 10,15 ± 1,93 Розавин 652,8 9 20,72 ± 2,11 Розарин 725,4 6 1,59 ± 0,37 Розин 975,6 2 6,39 ± 0,93 398 Sergeeva I.Yu. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 3, pp. 393–403 в популяции этой эколого-географической зоны сформировано салидрозида. Отличительной особенностью данной популяции родиолы розовой является наличие коричного альдегида. Сравнительная оценка количественного содержания по сумме трех одинаково обнаруженных и идентифицированных в корневище с корнями трех популяций родиолы розовой (рис. 4) показала, что максимальное накопление салидрозида отмечено в популяции родиолы розовой, районированной в Горном Алтае. При этом в результате вторичного метаболизма в популяциях растения Кузнецкого Алатау и Бурятии синтезируется соизмеримое количество розавина. Вследствие обнаружения большего спектра БАВ в корневище с корнями популяции родиолы розовой Горного Алтая исследовали надземную биомассу этой популяции (рис. 5, табл. 4). Выявлено высокое накопление пяти фитохимических соединений. Установлено, что на долю трицина и его производных приходится более половины (56,6 %) от всего объема идентифицированных БАВ. Почти третью часть (27,9 %) занимает астрагалин, 15,6 % – тирозол. Анализ биоматериала корневищ с корнями и надземной биомассы родиолы розовой, интродуцированных из трех эколого-географически отдаленных ареалов, позволил установить, что они существенно отличаются по содержанию биологически активных веществ. Изменчивость показателей по одним и тем же компонентам БАВ связана с почвенно-климатическими факторами местообитания растений: световым, тепловым, водным и питательным режимами фрагментарных почв. Для практического извлечения максимального количества и привлечения в пищевые биотехнологии можно рекомендовать биоматериал, районированный по территориям: розавин, салидрозид и метилгаллат – Кузнецкий Алатау; салидрозид, галловая кислота, дафнетицин и розеин – Горный Алтай; метилгаллат, розавин и коричный альдегид – Тункинские хребты; трицин и его производные, астрагалин и тирозол – из надземной биомассы родиолы розовой в популяции Горного Алтая. От степени развития морфометрических характеристик растения зависит уровень фотосинтеза и накопления пластических веществ в корневищах. Это дает прогноз того насколько можно ожидать разницу в накоплении общей биологической Рисунок 4. Количественное содержание БАВ по сумме трех равно обнаруженных и идентифицированных в корневище с корнями исследуемых популяций родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) Figure 4. Quantitative content of biologically active substances in the rhizome and roots of the three samples of Rhodiola rosea L. Рисунок 5. Хроматограмма этанольного извлечения фенолов из надземной биомассы родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) в популяции Горного Алтая Figure 5. Chromatogram of ethanol extraction of phenols from the top biomass of Rhodiola rosea L. (Gorny Altai) Таблица 4. Содержание фенольных соединений в надземной биомассе родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) из популяции Горного Алтая Table 4. Content of phenolic compounds in the top biomass of Rhodiola rosea L. (Gorny Altai) Компонент Время удерживания, сек Номер пика хроматограммы Количественное содержание, мг/г Астрагалин 1068,30 8 38,94 ± 2,21 Трицин-5-О-β-D-глюкопиранозид 1123,79 10 35,25 ± 1,66 Трицин-7-О-β-D-глюкопиранозид 1152,96 9 30,23 ± 1,45 Тирозол 1477,08 14 21,80 ± 1,21 Трицин 1754,94 2 13,07 ± 0,72 399 Сергеева И. Ю. Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 3 С. 393–403 продуктивности корневищ и травянистой части, с одной стороны, фотосинтетической продуктивности, с другой. Побег и листья имеют хорошо выраженную зеленую окраску. Но важно понимать насколько изучаемые популяции различны по накоплению фотосинтетических пигментов, имеющих значение в профилактике заболеваний и поддержании здоровья у разных групп населения. В данном исследовании представлены результаты измерений линейных параметров побегов в период весенней вегетации (2019–2020 гг.) (табл. 5) и анализа содержания фотосинтетических пигментов в надземной массе родиолы розовой различных популяций (табл. 6). При культивировании интродуцированных популяций родиолы розовой отмечено, что образцы существенно отличаются по фенотипу растения, по размерам и форме листьев. Растения из популяции Горного Алтая сформировали куст из большего числа побегов (9–11 шт) по сравнению с образцами из Кузнецкого Алатау (5–7 шт) и Тункинских гольцов (Бурятия) (6–8 шт). В надземной биомассе родиолы розовой изучаемых популяций накапливается порядка 0,333 мг/г хлорофиллов а и b в суммарном выражении. При этом на треть меньше синтезируется каротиноидов. На этом фоне на диапазон от 9,6 % до 18,3 % больше накапливают хлорофиллы а и b образцы растения из популяции Кузнецкого Алатау и Горного Алтая. Последний из выше упомянутых имеет достоверное превышение по содержанию каротиноидов (на 26,3 %), в сравнении с показателями второго образца, но находится на одном уровне с показателями популяции родиолы розовой с Тункинских хребтов. В результате расчета коэффициентов корреляции между содержанием фотосинтетических компонентов с морфометрическим признаками (размерностью побегов, числом листьев на побеге и их плотностью) установлено только две положительно высоких зависимости – по содержанию каротиноидов и числа листьев (r = 0,89 ± 0,09) и по содержанию каротиноидов и длины побега (r = 0,96 ± 0,22) (табл. 7). По другим парам признаков корреляционные связи были статистически незначительными или средними. Таким образом, показана возможность извлечения фотосинтетических пигментов из Таблица 5. Средние параметры побегов родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) различных популяций (2019–2020 гг.) Table 5. Average dimensions of Rhodiola rosea L. shoots in different plant communities (2019–2020) Популяция растений Длина побега, см Число листьев, шт Плотность листьев Диаметр побега, мм в основании в середине под верхним листом Горный Алтай 13,20 ± 0,03 35,00 ± 0,68 9,40 ± 0,24 3,60 ± 0,05 3,10 ± 0,07 2,20 ± 0,08 Кузнецкий Алатау 8,18 ± 0,04 14,80 ± 0,11 7,26 ± 0,07 5,00 ± 0,06 3,80 ± 0,06 2,10 ± 0,06 Тункинские хребты 12,03 ± 0,09 42,20 ± 0,12 14,10 ± 0,11 4,80 ± 0,10 3,40 ± 0,07 2,50 ± 0,07 Таблица 6. Содержание фотосинтетических пигментов в надземной массе родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) различных популяций (2019–2020 гг.) Table 6. Content of photosynthetic pigments in the top mass of Rhodiola rosea L. from different plant communities (2019–2020) Популяция растений Содержание хлорофиллов, мг/г Содержание каротиноидов, мг/г (%) Соотношение хлорофиллов а b а + b а/b (а + b)/каротиноидов Горный Алтай 0,258 0,120 0,378 2,15 0,122 (32,3) 3,10 Кузнецкий Алатау 0,230 0,090 0,323 2,55 0,090 (27,9) 3,59 Тункинские хребты 0,212 0,085 0,297 2,49 0,115 (37,8) 2,58 Среднее 0,233 0,098 0,333 2,40 0,109 3,05 Размах варьировния 0,046 0,035 0,081 0,40 0,032 1,01 Таблица 7. Зависимость содержания фотосинтетических пигментов от морфометрических показателей растений Table 7. Content of photosynthetic pigments vs. morphometric dimentions of plants Показатели Коэффициент корреляции (R ± r) содержание хлорофилла a содержание хлорофилла b содержание хлорофиллов (a + b) содержание каротиноидов Длина побега 0,37 ± 0,10 0,63 ± 0,15 0,37 ± 0,08 0,96 ± 0,22 Число листьев 0,58 ± 0,09 0,43 ± 0,10 0,64 ± 0,13 0,89 ± 0,09 Плотность листьев 0,21 ± 0,06 0,17 ± 0,04 0,011 ± 0,03 0,65 ± 0,09 Диаметр побега 0,34 ± 0,010 0,18 ± 0,04 0,46 ± 0,11 0,21 ± 0,06 400 Sergeeva I.Yu. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 3, pp. 393–403 надземной биомассы родиолы розовой для целевого использования в пищевых технологиях. Однако в настоящее время для этих целей в большей мере используют фитохимические вещества из корневищ и корней. Выводы В ходе исследований идентифицировано 12 биоло- гически активных компонента фенольной природы из популяции родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) Горного Алтая. В корневищах с корнями установлено максимальное содержание (мг/г) галловой кислоты (10,26 ± 2,31), розеина (20,45 ± 3,46), дафнетицина (13,80 ± 2,30) и салидрозида (28,16 ± 2,27); в надземной части растения – астрагалина (38,94 ± 2,21), трицина (13,07 ± 0,72) и его производных – трицин-5-О-β-D-глюкопиранозида (35,25 ± 1,66), трицин-7-О-β-D-глюкопиранозида (30,23 ± 1,45), тирозола (21,80 ± 1,21). Идентифицировано 5 биологически активных компонентов фенольной природы из популяции родиолы розовой Кузнецкого Алатау с максимальным содержанием (мг/г) в корневищах с корнями розавина (16,89 ± 2,11) и салидрозида (14,35 ± 2,52). Идентифицировано 6 биологически активных компонентов фенольной природы из популяции родиолы розовой Тункинских хребтов Бурятии с максимальным содержанием (мг/г) в корневищах с корнями розавина (20,72 ± 2,11), метилгалата (39,00 ± 1,05) и коричного альдегида (10,15 ± 1,93). В среднем в надземной биомассе родиолы розовой изучаемых популяций накапливается порядка 0,333 мг/г хлорофиллов а и b в суммарном выражении. При этом каротиноидов синтезируется 0,109 мг/г по трем популяциям. Установлены коэффициенты корреляции между содержанием фотосинтетических компонентов с морфометрическим признаками. Обнаружены две положительно высоких зависимости – по содержанию каротиноидов и числа листьев (r = 0,89 ± 0,09) и по содержанию каротиноидов и длины побега (r = 0,96 ± 0,22). Для сохранения биоразнообразия ареалов родиолы розовой как вида, занесенного в Красную книгу Российской Федерации и в Красные книги большинства субъектов РФ, рекомендуется активно вводить уникальные растения в биотехнологии микроклонального размножения, селективного отбора форм с повышенным содержанием вторичных метаболитов и последующего выращивания в культуре in vitrо. Индивидуальный отбор генотипов с повышенными показателями БАВ и последующим введением в культуру in vitro позволит без ущерба для окружающей среды получать планируемый объём вторичных метаболитов. Критерии авторства И. Ю. Сергеева – аналитический обзор литера- туры, написание и общая редакция рукописи. А. В. Заушинцена – методология и организация исследований. Е. Н. Брюхачев – получение факти- ческого материала. Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Contribution I.Yu. Sergeeva reviewed scientific sources, wrote and proof-read the manuscript. A.V. Zaushintsena developed the methodology and supervised the research. E.N. Bryukhachev was responsible for obtaining the factual material. Conflict of interest The authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this article