ВведениеНа сегодняшний день биологически активныедобавки к пище (БАД) широко используются в пита-нии человека в России и еще в большем масштабеза рубежом. Все большую актуальность приобретаетиспользование БАД в рационе лиц, ведущих активныйобраз жизни, и спортсменов для восстановления послеинтенсивных тренировок [1].В качестве сырья для производства БАДиспользуют различные гидролизаты растительного иживотного сырья. БАД на основе водных экстрактовиз сыра Коопех с белковыми ультрафильтрационнымифракциями менее 2 кДа обладает антимикробнойактивностью в отношении Pseudomonas aeruginosa,Bacillus cereus и Salmonella enterica, а с фракциямиболее 2 кДа, в которых доминируют пептиды смолекулярными массами 3896,91, 3937,42, 3926,57,3702,51 и 3692,87 Да, имеют антиоксидантнуюактивность [2].Гидролизат перьевого белка, полученный спомощью антарктической кератинолитическойбактерии Pedobacter sp. 3.14.7, обладает высокойантиоксидантной активностью. Этот штамм бактерииразлагает сырое перо в белковый гидролизатпри условиях 30 г пера/литр воды, рН 6,0 итемпературе 20 °С. Разработанный ферментативныйгидролизат предполагается использовать в качестведополнительного источника белка и антиокси-данта [3].Л. В. Федуловой и Э. Б. Кашиновой разработанабиологически активная добавка в форме экстрактовподжелудочной железы, слизистой оболочки желудкаи двенадцатиперстной кишки свиней [4]. Такиеэкстракты имеют различную молекулярную массуот 50 до 2 кДа. Исследованиями in vitro доказано, чтовнесение БАД в количестве 100 нг/мл в питательнуюсреду для эксплантатов желудка и кишечника10-дневных куриных эмбрионов стимулируетих рост. При этом наибольшей активностьюобладает низкомолекулярная фракция пептидовс молекулярной массой менее 5 кДа. Отмеченодостоверное повышение индекса площади (ИП)эксплантатов тканей желудка и кишечника на 60и 50 % относительно контроля с образованиеммонослоя эпителиоцитов, характеризующиеся высокойпролиферативной активностью.K. Raja с соавторами разработан экстрактсырой кожи морского сома Tachysurus dussumieriи исследована его противоопухолевая эффективностьна клеточной линии рака толстой кишкичеловека методом МТТ-анализа. Концентрациюингибирования (IC50) получали по 600 мкг/млчерез 24 ч [5]. Фрагментация ДНК и результатыпроточной цитометрии показали, что экстракт кожиморского сома индуцирует конденсацию хроматина,апоптотическую гибель клеток, а также нарушаетклеточный цикл в фазе G0/G1 на линии клеток ракатолстой кишки (рис. 1).БАД, полученная ферментативным гидролизоммышечного белка Oratosquilla woodmasoniс использованием термолизина и пепсина споследующей ультрафильтрацией на мембраннойAbstract.Introduction. Today, dietary supplements are an integral part of human diet. Some of them are made of hydrolysates of animalorigin. Biologically active additives of immunomodulatory action can prevent various diseases. The research objective wasto develop a dietary supplement from the bursa of Fabricius obtained from broiler chickens and evaluate its effect on cellviability in culture.Study objects and methods. The study featured biologically active supplement obtained by enzymatic hydrolysis of the bursaof Fabricius, immature stem cells, and adult differentiated cells of human dermal fibroblasts, HeLa and MCF-7 cancer cells,and extract of the bursa of Fabricius.Results and discussion. The research resulted in a new technology of dietary supplement production from the bursa of Fabriciusof broiler chickens. It included washing, cutting, homogenization, proteolytic enzyme fermentation, and ultrafiltration. Whenintroduced into the culture of mesenchymal stem cells, the dietary supplement caused a slight decrease in the cell viability atconcentrations of 25 and 50%, which indicated a possible cytotoxic effect of the extract on mesenchymal cells. The extractdid not affect the viability of human fibroblast culture and caused no cytotoxic effect. In MCF-7 culture, the extract had adose-dependent cytotoxic effect, which lowered the relative cel l viability.Conclusion. The new dietary supplement based on the bursa of Fabricius of broiler chickens had a cytotoxic effect on stemcell cultures. However, it did not affect the cell viability and had no cytotoxic effect on human dermal fibroblasts. The effectdepended on the cell culture. In the case of HeLa, the supplement stimulated proliferative activity, and in the case of MCF-7,it had a cytotoxic effect. Therefore, the new dietary supplement demonstrated some prospects as an active ingredient forvarious biologically active additives and immunomodulatory drug s.Keywords. Dietary supplement, cell cultures, cell viability, broiler chic kens, fabricium bag, immunomodulator, peptidesFor citation: Kolberg NA, Tikhonova NV, Tikhonov SL, Leontieva SA. Effect of Dietary Supplement from Lymphoid Tissueof Chickens on Cell Viability. Food Processing: Techniques and Technology. 2021;51(3):492–502. (In Russ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2021-3-492-502.494Kolberg N.A. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 3, pp. 492–502установке, очисткой с помощью гель-фильтрационнойхроматографии (GFC) и быстрой белковой жидкостнойхроматографии (FPLC), состоит из 5 аминокислотныхпоследовательностей (Asn-Gly-Val-Ala-Ala) с моле-кулярной массой 431 Да через LC-MS/MS TH1-A1(рис. 2). Исследованиями доказано, что БАД-пептидне оказывает токсического действия на клетки MCF-7и имеет высокую антиоксидантную активность при рНот 2 до 10. Пептид может быть лучшей альтернативойнутрицевтической и функциональной пище последополнительных исследований [6].F. Rivero-Pino и др. получены БАД биоактивныепептиды, выделенные из белка насекомых спомощью ультразвука [7]. Кратковременноедействие ультразвуковых волн на сырье увеличивалопоследующее высвобождение биоактивных пептидов,но более длительное время ультразвуковойобработки ограничивало их производство. Гидролизсубтилизина не позволил высвободить ингибирующиеα-глюкозидазу пептиды. Но он необходим длярасщепления белка, до того как трипсин высвободитэти пептиды. Эти высокоактивные гидролизаты вформе БАД, которые могут быть использованы вкачестве ингредиента, регулирующего гликемическийиндекс в рецептуре пищевых продуктов.Сегодня особую актуальность в биотехнологииприобретают методы оценки эффективностиновых БАД животного происхождения in vitro(«в пробирке»). Эксперименты проводятся внеживого организма с использованием культур живыхклеток или бесклеточных моделях, применяющиесяв различных областях: молекулярной биологии,биохимии, фармакологии, медицине, генетике и др. Запоследние годы методы in vitro находят все большееприменение в различных областях. Возможностьиспользования клеточных культур в экспериментахв настоящее время широко используется с цельюпрогнозирования токсических и терапевтическихэффектов биологически активных веществ животногопроисхождения. Это связано с возможностью оценитьвзаимодействие изучаемых веществ с клеткой в«чистом виде», выявлять изменения клеточныхи субклеточных структур, которые в условияхцелостного организма могут маскироваться иливидоизменяться компенсаторными и регуляторнымимеханизмами единой системы [8].M. Taroncher и др. проведено исследованиес целью определения цитотоксичности ТоксинТ-2 (трихотецен типа А, продуцируемый видамиFusarium) на клетках гепатокарциномы человека(HepG2); оценки наличия адаптивного ответа клетокHepG2 при воздействии низких концентрацийТ-2; идентификации метаболитов Т-2 с помощьюLC-Q-TOF MS; нарушение Т-2 пролиферации клетокв клетках HepG2 [9]. IC50 полученные значенияварьировались от 61,9 ± 2,4 Нм до 70,7 ± 7,4 Нм.Адаптивной реакции не наблюдалось. Не былоникаких доказательств экстра- или внутриклеточногонакопления Т-2 после 24 ч воздействия, как этоопределено LC-Q-TOF. Однако некоторые метаболитыТ-2, такие как токсин HT-2, неосоланиол и триолТ-2, показали важное (> 75 %) внутриклеточноенакопление. Распределение клеток было значительноувеличено в фазе SubG0/G1 (в 11,8 раза выше) иуменьшено (на 12 %) в фазе G2/M при 60 нМ Т-2 посравнению с контролем. Одновременно в клеткахHepG2, подвергнутых воздействию Т-2, наблюдалсяповышенный некроз (238 %) и апоптоз/некроз (до35,5 %). Исследования авторов доказывают, что Т-2приводит к потере жизнеспособности клеток безадаптивного ответа и что образующиеся метаболитыиграют важную роль в цитотоксичности Т-2,увеличивая повреждение клеток HepG2.Для использования биотехнологических методовпри исследовании жизнеспособности культурклеток необходимо разработать биопроцессы,обеспечивающие соответствующие условия для ростастволовых клеток от низких начальных количествдо желательных значений. L. Shafiei Kaleybar сРисунок 1. Схема получения и влияние экстракта кожиморского сома на клеточную линию рака толстойкишки человекаFigure 1. Sea catfish skin extract: productionand effect on human colon cancer cellsРисунок 2. БАД, полученная ферментативнымгидролизом мышечного белка Oratosquilla woodmasoniFigure 2. Biologically active supplement obtained by enzymatichydrolysis of Oratosquilla woodmasoni muscle proteinЭкстракт кожиПротивораковая активностьв отношении линии клетокрака толстой кишки человекаTachysurusdussumieriФерментативныйгидролизИнгибиро-вание АПФ иантиоксидантныесвойстваФункциональныесвойстваOratosquillawoodmasoni495Кольберг Н. А. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 3 С. 492–502соавторами был разработан и смоделирован простойи эффективный концептуальный биопроцесс наоснове перемешиваемого резервуарного биореактора,содержащего внутреннюю трубку с секвенирующейсистемой порционной аэрации для прогнозированияпроизводительности массового производствасуспендированных стволовых клеток [10]. Исходяиз конструктивных параметров биопроцесса, атакже характеристик клеток и конечной плотностиклеток, общий объем биореактора, необходимыйкак для жидкой, так и для газовой фаз, был выбран400 мл, включая внутреннюю трубку диаметром ивысотой 2 и 10 см соответственно. Система аэрациирассматривалась в зависимости от нормы расхода О2и нормы выработки СО2 в качестве суточной заменыобщей газовой фазы (при положительном давлении1 %). Обмен среды также рассматривался как заменаполовины жидкой фазы новой средой каждые тридня. После записи соответствующих балансов массыбиопроцесс моделировался, а производительностьсистемы прогнозировалась на 10-дневный периодкультивирования. Разработанная биореакторнаясистема предсказала, что окончательное количествоклеток может быть достигнуто в течение 10-дневногокультивирования из небольшой биопсии безпроблем, вызванных нехваткой или критическимнакоплением каких-либо материалов. Концептуальноемоделирование биопроцесса и прогнозированиепроизводительности показали большой потенциал дляизучения системы культивирования для производствасуспендированных стволовых клеток.Аутофагия – важный катаболический путь,играющий важную роль в физиологическойфункции печени. Результаты исследований [11]свидетельствуют о том, что воздействие 3-хлор-1,2-пропандиол (3-MCPD токсикант, образующийсяпри термической обработке некоторых пищевыхпродуктов) вызывает токсичность в печени, номеханизм остается неизвестным. Также в даннойработе авторы исследовали влияние 3-MCPD нааутофагический поток и проследили молекулярныймеханизм в клетках HepG2 [11]. Полученные данныепоказали, что воздействие 3-МКПД способствуетнакоплению аутофагосом в клетках HepG2. 3-MCPDможет индуцировать блокировку аутофагическогопотока в клетках HepG2. Возможный механизм былобусловлен разрушением лизосомальной функции.A. M. Abdel-Aty и др. проведено исследованиеметодами биотехнологии цитотоксическойактивности БАД из латексных экстрактоврастений Ficus carica (FCE), Ficus sycomorus (FSE)и Euphorbia tirucalli (ETE) [12]. Доказано, чтоБАД из латексных экстрактов ETE, FCE и FSEоказала мощное цитотоксическое действиесовместно с доксорубицином, распространеннымпротивоопухолевым препаратом, против острыхмиелоидных лейкозов HL-60, линий раковыхклеток молочной железы MCF-7 и печени HepG2соответственно. Кроме того, все тестируемыеэкстракты не оказывали токсического воздействияна нормальные меланоциты человеческой клеточнойлинии HFB4 в концентрациях до 100 мкг/мл.В работе [13] изучалась противоопухолеваяэффективность БАД из трех тритерпеноидов,полученных из этилацетатного экстракта Cassiafistula L., против линии клеток рака толстойкишки человека (HT-29). Тритерпеноиды оказалисьнетоксичными для нормальных клеток VERO, ноцитотоксичными для раковых клеток. АнализRT-ПЦР показал, что тритерпеноиды продуцировалиповышенную регуляцию экспрессии р53 ипониженную экспрессию ERK2. Скорость инвазиии метастазирования значительно снижалась при ихвоздействии. Кроме того, антиоксидантная активностьпроявлялась в разрушении раковых клеток. Результатыисследований показали стабильные взаимодействиямежду тритерпеноидами и мишенями рака (p53и ERK2). Полученные данные свидетельствуюто том, что тритерпеноиды проявляют высокийантипролиферативный эффект в клетках НТ-29 иперспективны в качестве альтернативной терапиионкологических заболеваний.В результате исследований M. M. Farid и др.разработана БАД из растительного экстрактаKermia aegyptiaca [14]. Полученная БАД былаисследована методами биотехнологии против двухлиний опухолевых клеток человека: молочнойжелезы (MCF-7) и толстой кишки (HCT-116).Установлен высокий процент цитотоксичности БАДпри концентрации 100 мкг/мл с 91,1 и 37,9 противMCF-7 и HCT-116 соответственно.Авторами [15] разработана БАД из грибаAspergillus oryzae и доказана ее активность in vitroв отношении выбранной клеточной линии рака легких.В работе A. Juan-García с соавторами доказаноцитопротекторное действие БАД из экстракта чеснокаAllium sativum L. на клетки гепатокарциномы HepG2.БАД оценивали против боверицина (BEA) и двухзеараленонов [16]. Метаболиты (α-зеараленол(α-ZEL) и β-зеараленол (β-ZEL)) индуцировалицитотоксичность на клетках HepG2 методом МТТ(3-4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолийбромид) в течение 24 и 48 ч. При обработке клетокHepG2 БАД их жизнеспособность клеток была вышена 40–50 %.Доказано, что БАД на основе рофлумиластаусиливает цитотоксические и апоптотические эффектыв клеточной линии PC3 [17].Результаты исследований M. S. Rahaman и др.с помощью Вестерн-блот-анализа показали, чтопредварительная обработка куркумином и D-пинитоми их комбинированная обработка мышьякомингибировали индуцированную мышьяком гибельклеток путем активации белков про-выживания,496Kolberg N.A. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 3, pp. 492–502хотя экспрессия этих белков отрицательнорегулировалась мышьяком [18]. Кроме того, эффекткомбинированного лечения куркумином и D-пинитомбыл сильнее, чем при индивидуальном лечении.Эпидемиологические данные способствуютвключению БАД на основе флавонов в рацион питанияиз-за их ингибирующего действия на некоторыевиды рака, особенно у женщин. Среди природныхрастительных флавоноидов апигенин 7-О-глюкозид(AGL) обладает противовоспалительной, антиокси-дантной и противораковой активностью. Однакомеханизм его действия на рак шейки матки,четвертый по величине рак у женщин, до сих порне выяснен. M.-M. Liu и др. установили влияниеAGL на клетки рака шейки матки человека и изучилиего молекулярный механизм против рака шейкиматки [19]. Результаты показали, что AGL ингибируетпролиферацию клеток HeLa (IC50 составлял47,26 мкм через 48 ч), индуцируя апоптоз. В то жевремя в клетках HeLa, обработанных AGL, путьPTEN/PI3K/AKT ингибировался концентрационно-зависимым образом. Миграция клеток также былазатруднена через матриксную металлопротеиназу2 и 9 соответственно.Следует отметить, что БАД, имеющие в своемсоставе пептиды, иммуномодулирующего действияоказывают влияние не только на иммуноциты,опухолевые клетки, но и на все клетки организма.Поэтому целью исследования стала разработка БАДиз фабрициевой сумки цыплят-бройлеров и оценкаее влияния на жизнеспособность клеток в культуре.Объекты и методы исследованияОбъектами исследования являются биологическиактивная добавка, полученная ферментативнымгидролизом фабрициевой сумки, а также клетки.Эксперименты проводили на нескольких типахклеточных культур:– на культуре незрелых стволовых клеток;– на культуре зрелых дифференцированных клеток –дермальные фибробласты человека;– на культуре опухолевых клеток линий HeLa иMCF-7.Данные группы клеток отличаются по степенизрелости, возможности дифференцировки,функциональным способностям, пролиферативнойактивности и чуствительности к внешним факторам.Культура мезенхимальных клеток (МСК) выделенаиз берцовой кости крысы. МСК представляют собойнормальные фибробластоподобные веретеновидныеклетки, характеризующиеся высокой пластичностьюи способностью дифференцироваться в другиетипы клеток (рис. 3). Выделение мезенхимальныхклеток проводили с отделением эпифизов берцовойкости в стерильных условиях и последующимвымыванием костного мозга из костномозговогоканала. Полученные клетки осаждали путемцентрифугирования и культивировали в пластиковыхфлаконах на питательной среде.Культура фибробластов человека получена изматериала биопсии кожи в Институте медицинскихклеточных технологий (Екатеринбург, Россия).Фибробласты представляют собой нормальныеклетки соединительной ткани (рис. 4). Данныйтип клеток удобен для проведения исследования,поскольку при длительном пассировании сохраняетсякариотип клеток и их нормальные свойства. Этопозволяет видеть точные и неискаженные результаты.Выделение фибробластов проводили из биопатов кожипутем ферментативной обработки и последующегоинкубирования в питательной среде с соблюдениемвсех необходимых условий (температура, состав газа).Клеточная культура карциномы шейки маткичеловека HeLa получена из Российской коллекцииклеточных культур Института цитологии РАН,г. Санкт-Петербург (рис. 5). Это культура опухолевыхРисунок 3. Клеточная культурамезенхимальных стволовых клеток крысы(окраска по Романовскому-Гимзе; ув. ×400)Figure 3. Cell culture of rat mesenchymal stem cells(Romanovsky-Giemsa stain; magnification ×400)Рисунок 4. Культура дермальных фибробластовчеловека (окраска по Романовскому-Гимзе, ув. ×400)Figure 4. Human dermal fibroblasts cells(Romanovsky-Giemsa stain, magnification ×400)497Кольберг Н. А. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 3 С. 492–502клеток, способная неопределенно долго растиin vitro за счет наличия фермента теломеразы.Использование препарата на данном типе клетокпозволяет определить его цитостатический эффект.Клеточная культура аденокарциномы молочнойжелезы MCF-7 также получена из Российскойколлекции клеточных культур Института цитологииРАН [6]. Простота использования клеточных линийпозволяет проводить доклинические исследованиялекарственных средств с целью расширенияфундаментальных знаний о природе опухолевыхклеток.Все подготовительные этапы работы, связанные синкубированием клеток и приготовлением растворов,проводили в стерильных условиях в ламинарномбоксе БАВнп-01-«Ламинар-С»-1,2 LORICA. Культи-вировали клетки в питательной среде DMEM(Биоолот, Россия) с добавлением 10 % эмбриональнойтелячьей сыворотки и гентамицина в дозе 50 мкг/мл дообразования монослоя. Культивирование проводилив СО2 инкубаторе Sanoy (Panasonic) МСО-18АС притемпературе 37 °С в атмосфере с 5 % СО 2.Микроскопический контроль среды проводилис помощью инвертированного микроскопа EclipseTS100 (Nikon). В зависимости от достижения клеткамимонослоя меняли культуральную среду каждые 3 дня.Пересев клеточной культуры проводили одинраз в 3–4 дня путем дезагагригирования клеточногомонослоя с использованием трипсина.Исследование разработанной БАД проводилина культурах клеток в следующих концентрациях0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 25, 40 и 50 %. Каждуюконцентрацию вносили в культуру клеток в количестве6-ти повторений. Минимальное количество БАД,которое можно внести в культуру, – 1 мкл. БАДв данном количестве вносили на 100 мкл, чтопозволило получить концентрацию равную 0,5 %.При разведении в 5 раз концентрация равна 10 %.Также БАД вносили в количестве 1 мкл на 100 мклдля получения концентрации 0,1 %. Разведениев 10 раз с аналогичным внесением в лунки далоконцентрацию 0,05 %.Исследования влияния БАД начинали с подготовкиклеточных культур. Для этого клетки переводилииз монослоя в суспензию. Подготовленнуюсуспензию клеток в 10 мл питательной средыпомещали в 96-луночные планшеты в количестве100 мкл суспензии на одну лунку. Культивированиепроводилось в течение 24-х ч. После чего в лункидобавляли исследуемый препарат в разных объемах.Через 48 ч после введения препарата проводиласьоценка жизнеспособности клеток в клеточнойкультуре. Полученные данные сопоставляли сконтролем и анализировали статистическим способом.Для оценки жизнеспособности клеток использовалиМТТ-тест. В каждую лунку планшета, в которомпредварительно были культивированы клетки и внесенпрепарат, добавляли МТТ-краситель (тетразолиевыйкраситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5- дифенил–тетразолиум бромид) по 20 мкл. Затем планшетставили в термостат на 2 ч. МТТ-краситель поддействием живых клеток превращается в пурпурно-синие клеточные кристаллы МТТ-формазана,количество которого эквивалентно количествуживых клеток. После инкубации культуральнуюсреду и краситель осторожно сливали и в каждуюлунку вносили по 100 мкл DMSO для растворенияобразовавшихся кристаллов формазана. После 5–7 миндетектировали фиолетовое окрашивание с помощьюспектрофотометрического сканера Tecan Infinite M200PRO при длине волны 570 нм.На основе полученных данных определялииндекс цитотоксичности для каждой концентрациииспытуемого экстракта. Затем определяли индекспролиферации для каждой концентрации исследуемогоэкстракта.Рисунок 5. Культура карциномы шейки матки человекаHeLa (окраска по Романовскому-Гимзе; ув. ×400)Figure 5. Human cervical carcinoma cells of HeLa line(Romanovsky-Giemsa stain; magnification ×400)Рисунок 6. Культура аденокарциномымолочной железы MCF-7(окраска по Романовскому-Гимзе; ув. ×400)Figure 6. MCF-7 breast adenocarcinoma cells(Romanovsky-Giemsa stain; magnification ×400)498Kolberg N.A. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 3, pp. 492–502Степень гидролиза белка определяли по разницемежду общем и аминым азотом. Аминный азот –по ГОСТ Р 55479-2013; общий азот и белок –методом Кьельдаля. Анализ молекулярно-массовогораспределения белково-пептидных фракций в составебиологически активной добавки проводили методомэксклюзионной жидкостной хроматографии среднегодавления на ВЭЖХ Agilent 1260 Infinity II.Статистическую обработку результатов проводили,используя компьютерную программу «MicrosoftExcel». Вычисляли среднее и стандартное отклонение.Результаты экспериментов представлены в видедиаграммы как среднее значение ± ошибка среднего.Для оценки значимости различий между группойконтроля и группой с использованием экстрактаприменяли непараметрический критерий Манна-Уитни. При вероятности ошибки P ≤ 0,05 различиямежду средними значениями считались достоверными.Результаты и их обсуждениеРазработана технология производства БАД излимфоидной ткани птицы (фабрициевая сумкацыплят-бройлеров), состоящая из промывкипроточной водой сырья, куттерования, гомогенизации,ферментирования, ультрафильтрации и упаковки.Целесообразно рассмотреть более подробнотехнологию БАД. Для производства БАД отбираютфабрициевую сумку после убоя цыплят-бройлеров ввозрасте 35 дней. Затем сырье помещают в емкостьи промывают проточной водой в течение 10 минпри температуре воды 16–18 °С.Следующим этапом производства БАД являетсякуттерование сырья в течение 3 мин при частотевращения ножей 2400 об/мин с последующейгомогенизацией. Сырье загружают в емкость гомо-генизатора, оборудованного рубашкой, наполненнойдистиллированной водой и имеющей встроенныйнагревательный элемент, гомогенизируют прискорости вращения насадки L5M компанииСильверсон (МВ) 6000 об/мин при температуре 4 °С.Указанную температуру задавали с помощьюнасоса и компрессора холодильной установки,имеющихся в гомогенизаторе. Затем полученнуюмассу нагревали до температуры оптимума активностифермента папаина (40 °С), вносили фермент Papain(КФ 3.4.22.2), растворенный в фосфатно-буферномрастворе с рН 6,0 из расчета 0,15 % к основномусырью (фабрициева сумка), и выдерживали в течение8 ч. Оценку степени гидролиза белка проводилипо аминному азоту. В таблице 1 представленазависимость степени гидролиза белка фабрициевойсумки от времени ферментации.Установлено, что гидролиз белка происходит впервые часы ферментации сырья папаином. Через4 ч ферментации степень гидролиза составила27,4 %, через 8 ч – 31,3 %. Следовательно,целесообразно ферментировать фабрициеву сумкув течение 4 ч.Затем ферментированное сырье пропускали черезультрафильтрационную лабораторную установку.Все металлические детали установки, контакти-рующие с сырьем, выполнены из нержавеющейстали 12Х18Н10Т. Основным рабочим элементомустановки является ультрафильтрационная ячейка,которая представляет собой цилиндр длиной 900 ммс керамическими мембранами КУФЭ длиной 800 ммс размером пор 10 кДа, изготовленные из диоксидатитана анатазной модификации с напыленнымселективным слоем α-оксида алюминия.Ультрафильтрацию сырья проводили приследующих технологических параметрах: u ≥ 1,5 м/с;Р = 0,3 МПа; t = 20 ± 5 °С.По внешнему виду полученная БАД изфабрициевой сумки представляет собой непрозрачнуюТаблица 1. Зависимость степени гидролиза белкафабрициевой сумки от времени ферментацииTable 1. Effect of fermentation time on the protein hydrolysisdegree of the bursa of FabriciusВремя гидролиза, ч Степень гидролиза белка, %0 01 11,32 16,53 19,84 27,45 29,16 30,27 30,78 31,3Рисунок 7. Образцы полученной БАДиз фабрициевой сумкиFigure 7. Samples of the dietary supplement obtained fromthe bursa of Fabricius of broiler chickens499Кольберг Н. А. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 3 С. 492–502водную суспензию кремового цвета со слабымспецифическим запахом (рис. 7).При исследовании химического составаполученной БАД установлено, что содержаниебелка в ней было на уровне 18,3 % при наибольшемколичестве белков (74,5 %) с молекулярной массойменее 4 кДа.Таким образом, разработана технологияБАД из фабрициевой сумки, включающаяпромывку фабрициевой сумки цыплят-бройлеровпроточной водой, куттерование, гомогенизацию,ферментирование и ультрафильтрацию.Проведена оценка влияния разработанной БАДна жизнеспособность стволовых клеток.При внесении БАД в культуру мезенхимальныхстволовых клеток наблюдается незначительноеснижение жизнеспособности клеток при концентрациипрепарата в 25 и 50 %. Это свидетельствует овозможном цитотоксическом влиянии экстрактана мезенхимальные клетки, поскольку понижениежизнеспособности, по сравнению с контролем,составило 20 % (рис. 8).Установлено, что для концентрации препарата в25 % индекс цитотоксичности равен 20,30 ± 2,49 %,а для концентрации в 50 % индекс цитотоксичностисоставил 19,40 ± 2,45 %. Между влияниемэффективных концентраций достоверных различийне обнаружено.При внесении БАД в культуру фибробластовчеловека не наблюдается достоверного измененияжизнеспособности клеток. Это свидетельствует оботсутствии цитотоксического влияния, а также оботсутствии повышения жизнеспособности клеточнойкультуры (рис. 9).При внесении иммуномодулирующего препаратаБАД в культуру HeLa наблюдается увеличениежизнеспособность клеток при концентрациипрепарата в 20, 10 и 5 %. В сравнении с контролемжизнеспособность клеток повысилась на 48 % приконцентрации препарата в 20 % и на 44 % приконцентрациях 10 и 5 % соответственно. Однакопри концентрациях в 40 и 1 % нет достоверностиотличий от контроля (рис. 10).Поскольку БАД стимулирует пролиферациюопухолевых клеток, то для концентраций сэффективным действием на культуру посчитан индекспролиферации по приведенной в методике формуле.Для концентрации в 5 % индекс пролиферации равен45,50 ± 9,24 %; для концентрации 10 % он равен45,94 ± 9,11 % и для концентрации 25 % индекспролиферации составил 49,24 ± 5,58 %. Достоверныхразличий между эффективными концентрациями (5,10 и 25 % не выявлено).Таким образом, иммуномодулирующая БАДусиливает пролиферативную активность исследуемыхлиний клеточных культур и увеличивает ихжизнеспособность. Такой эффект может быть связанс высоким содержанием белков в препарате. Дляисследуемых культур клеток БАД служила ростовымфактором или митогеном, стимулирующим клеткиРисунок 8. Влияние БАД на жизнеспособностькультуры мезенхимальных стволовых клетокFigure 8. Effect of the dietary supplement on the viabilityof mesenchymal stem cellsРисунок 9. Влияние БАД на жизнеспособностькультуры фибробластов человекаFigure 9. Effect of the dietary supplement on the viabilityof human fibroblast cells020406080100концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 5099100101102Концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 50050100150200концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 50020406080100концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 50020406080100концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 5099100101102Концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 50050100150200концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 50020406080100концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 50Рисунок 10. Воздействие БАД на жизнеспособностькультуры клеток HeLaFigure 10. Effect of the dietary supplementon the viability of HeLa cells020406080100концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 5099100101102контроль 0,05 050100150200концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 50020406080100контроль 0,05 020406080100концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 5099100101102Концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 50050100150200концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 50020406080100концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 50020406080100концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 5099100101102контроль 0,05 0.1 050100150200концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 50020406080100контроль 0,05 020406080100концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 5099100101102контроль 0,05 0.1 050100150200концентрация БАДконтроль 0,05 0.1 0,5 1 5 10 25 50020406080100контроль 0,05 Концентрация БАД, % Концентрация БАД, %Концентрация БАД, %500Kolberg N.A. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 3, pp. 492–502к делению. Пептиды препарата взаимодействуютсо специфическими рецепторами мембраны клетки,инициируя клеточные сигнальные пути, приводящиек делению. Одной из причин митотического деленияклеток могло стать включение МАР-киназного каскадав ответ на внеклеточный стимул. АктивированнаяМАР-киназная система регулирует процессы митоза,дифференцировки и выживания клеток. Определенныегруппы МАР-киназ регулируются экзогеннымисигналами (белками), что позволяет говорить одостоверности данного предположения.При внесении БАД в культуру MCF-7 выявленодозозависимое цитотоксичное влияние экстракта накультуру, что приводит к уменьшению относительнойжизнеспособности (рис. 11).Для концентрации 10 % индекс цитотоксичностиравен 57,02 ± 3,95 %; для концентрации в 25 % этозначение равно 59,95 ± 4,94 %; для концентрации в50 % индекс цитотоксичности равен 69,74 ± 2,0 %.Для концентраций, оказывающих выраженныйцитотоксический эффект, выявлены достоверныеразличия между концентрациями 10 и 40 %. Этоуказывает на дозозависимое влияние БАД.Таким образом, исследуемая БАД проявилацитотоксическое действие на культуру клеток MCF-7.Поскольку пептиды БАД обладают физиологическойактивностью, то воздействие на опухолевые клеткииндуцировалось ферментами апоптоза, что вызываетгибель клеток MCF. Рецепторы опухолевых клетокпередают внеклеточный сигнал, что приводит кзапуску протеолиза. Механизм апоптоза индуцируетсякомплексом белков, совместное действие которыхведет к множеству внутриклеточных изменений,приводящих к гибели клетки, что отмечается внаших исследованиях.БАД проявила цитотоксические свойства ив отношении культуры клеток аденокарциномымолочной железы, и в отношении культурымезенхимальных стволовых клеток. Сравнениепоказателей цитотоксичности позволяет сделать выводо том, что наиболее выраженный цитотоксическийэффект проявляется в отношении клеток MCF-7. Онзаключается в уменьшении количества опухолевыхклеток, что согласуется с исследованиям [13]. В немустановлено, что вещества иммуномодулирующегодействия влияют не только на клетки иммуннойсистемы, но и на непосредственно злокачественныеклетки либо опосредованно через незлокачественныеклетки, поддерживающие опухолевое образование.ВыводыРазработана технология БАД из фабрициевойсумки цыплят-бройлеров, включающая промывкусырья проточной водой, куттерование, гомогенизацию,ферментирование протеолитическим ферментом иультрафильтрацию. Проанализировано влияниеБАД на жизнеспособность и пролиферативнуюактивность культуры стволовых клеток. БАДоказывает цитотоксический эффект на данныйтип клеточной культуры. Изучено влияниеБАД на жизнеспособность и пролиферативнуюактивность культуры дифференцированныхсоматических клеток. Экстракт не оказываетвыраженного влияния на жизнеспособность ине проявляет цитотоксического действия поотношению к дермальным фибробластам человека.Исследовано влияние БАД на жизнеспособность ипролиферативную активность опухолевых клеток.Действие БАД оказалось различным в отношениикультур клеток. В случае с HeLa БАД стимулируетпролиферативную активность, а в случае с MCF-7оказывает цитотоксический эффект.Следовательно, БАД-ферментативный гидро-лизат фабрициевой сумки цыплят-бройлеровимеет перспективы использования в качестведействующего начала в составе различных биоло-гически активных добавок к пище или отдельно вкачестве специализированного пищевого продуктаиммуномодулирующего действия, в частности БАДфункциональной направленности.Критерии авторстваАвторы в равной степени принимали участие висследованиях и оформлении рукописи.Конфликт интересовАвторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.ContributionAll the authors contributed equally involved in theresearch and design of the manuscript.Conflict of interestThe authors declare that there is no conflict of interestregarding the publication of this article.