ВведениеСовременной тенденцией, стимулирующей рост потребительского спроса, является обогащение пищевой продукции биологически активными и функциональными ингредиентами [1, 2]. Настороженное отношение потребителей к пищевым добавкам и выполнение требований технических регламентов Таможенного союза о необходимости информирования потребителей о возможном отрицательном влиянии на активность и внимание детей некоторых синтетических красителейспособствуют росту производства пищевых продуктов, в состав которых входят красители природного происхождения. Пищевой краситель бета-каротин Е160a, являющийся также провитамином А, активно применяется в производстве различной пищевой продукции, в том числе функциональной [3–5]. В соответствии с Методическими рекомендациями МР 2.3.1.2432-08 рекомендованная норма потребления бета-каротина, определяемая физиологической потребностью организма взрослого человека, составляет 5 мг/сут, а верхний допустимый уровеньRudometova N.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 2, pp. 374–386 поступления не должен превышать 10 мг/сут [6]. Для предотвращения избыточного потребления бета- каротина и возникновения побочных эффектов и осложнений необходимо учитывать все источники его поступления в организм человека, в том числе поступления в качестве пищевого красителя Е160а. Максимально допустимые уровни (МДУ) красителя Е160а в различной пищевой продукции установлены стандартом Кодекса Алиментариуса CODEX STAN 192-1995 ФАО-ВОЗ на основе величины допустимого суточного поступления и массы продукта в пищевом рационе взрослого человека. МДУ зависит от сырьевого источника, способа получения красителя и вида пищевой продукции, в которой предполагается его использование. Например, если краситель получен методами химического или микробного синтеза, то МДУ в креме на основе растительных жиров для всех видов каротина составляет 20 мг/кг, в сладких соусах100 мг/кг; если получен из съедобных растений20 г/кг. Аналогичные требования предполагается ввести и в новую редакцию Технического регламента Таможенного союза ТР ТС 029/2012.Бета-каротин – непредельный углеводород из группы каротиноидов (рис. 1). Он обладает большим промышленным значением из-за довольно широкого спектра экономически выгодных способов его получения. Пищевой краситель Е160а может быть получен методом химического синтеза, ферментацией зигомицета Blakeslea trispora, экстракцией из съедобных растений или водорослей вида Dunaliella salina [7–10].Каротиноиды в составе пищевых матриц относительно стабильны при термической обработке [11, 12]. Однако в растворах они чрезвычайно чувствительны не только к нагреванию, но и к воздействию кислот, кислорода и света [13]. Подвергаясь окислению, каротиноиды нейтрализуют синглетный кислород, поэтому являются мощными антиоксидантами. Окислительное разложение бета-каротина представляет собой сложный  Рисунок 1. Структурная формула молекулы бета-каротинаFigure 1. Structural formula of beta-carotene moleculeмногостадийный процесс, протекающий через образование промежуточных моно- и бирадикальных форм, апокаротеналей и других соединений [14]. Поэтому при работе с каротиноидами необходимы меры предосторожности, такие как проведение экспериментов в темноте, в атмосфере азота или аргона, хранение при температуре 20 °C и использование стабилизаторов. Химическая структура каротиноидов с их длинной углеродной цепью и конъюгированнными двойными связями предопределяет их свойства как нейтрализаторов свободных радикалов и иммуномодуляторов [15, 16]. Обесцвечивание каротиноидов при окислении свидетельствует о том, что антиоксидантное действие каротиноидов связано с наличием в их структуре большого числа ненасыщенных связей [17]. Однако бета-каротин может функционировать и как активатор окислительных процессов [18]. Как соединения с сопряженными двойными связями, каротиноиды имеют характерные спектры поглощения, характеристики которых приведены в таблице 1 [19–21].Из-за высокой лабильности, нерастворимости в водных средах и сложностей при дозировании кристаллический бета-каротин практически не используется в пищевой промышленности. Перечисленные недостатки могут быть частично устранены при использовании красителя в виде комплексных пищевых добавок. В их состав входят различные пищевые добавки и ингредиенты, чьи действия направлены на стабилизацию или модификацию свойств бета-каротина в результате образования наноэмульсий, липосом, наноструктур, супрамолекулярных комплексов и клатратов [22–33]. Уменьшение деградации лабильных каротиноидов достигается при одновременном использовании щадящих технологических режи- мов и стабилизированных форм ингредиента [34]. Содержание бета-каротина в комплексных пищевых добавках составляет от 1 до 10 %. По информации производителей в составе комплексных пищевых добавок, кроме бета-каротина, содержатся антиокси- данты (Е222, Е300, Е304, Е307, Е320, Е321),эмульгаторы (Е433, Е471, Е494), консерванты (Е202, Е211), носители, стабилизаторы и загустители (Е414, Е420, Е422, Е551, Е1520). Наличие таких добавок, особенно эффективных эмульгаторов, приводит к необходимости разрушения эмульсионной системы для последующего количественного определения бета-каротина.При извлечении красителя из водорастворимых или содержащих воду матриксов экстрагент должен смешиваться с водой [17]. Эффективность экстракции каротиноидов определяется их структурой и свойствами. Поскольку бета-каротин является липофильным соединением, то он хорошо экстрагируется неполярными растворителями.Рудометова Н. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 2 С. 374–386 Таблица 1. Спектральные характеристики пищевых красителей каротиноидной природыTable 1. Spectral characteristics of food dyes of carotenoid nature КрасительПоказательРастворительλ max, нм Бета-каротин Е160а (i)циклогексан4552500хлороформ4612396ацетон4532550этанол4502620Аннато (биксин) Е160bхлороформ4932870Ликопин Е160dгексан4703450хлороформ484–этанол472–Бета- апокаротиналь Е160ециклогексан4612640хлороформ477–этанол463–Астаксантин Е160jхлороформ485–ацетон480–этанол478–Лютеин Е161bхлороформ:этанол 10:904452550 В хорошо исследованных процессах экстракции каротиноидов из различного растительного сырья используется широкий спектр растворителей: этанол, ацетон, петролейный эфир, гексан, бензол, тетрагидрофуран, диэтиловый эфир и хлороформ [35–38]. При этом смеси растворителей, содержащие полярный и неполярный компоненты, например, гексан и ацетон или гексан и этанол, являются лучшими экстрагентами для извлечения каротиноидов [10, 16, 35, 38]. Для выделения бета-каротина из эмульсионных и липосомальных форм также используются многокомпонентные экстрагенты [24, 26]. В целях предотвращения фотохимического распада, сокращения времени анализа и интенсификации процесса предлагается проводить экстракцию бета-каротина диоксидом углерода в до- и сверхкритических условиях и при воздействии ультразвука и микроволн [9, 16, 39–43]. Необходимость дополнительной очистки, деградация и неполное извлечение каротиноидов из эмульсионных сред приводит к серьезным затруднениям при их анализе и большой погрешности определения [44, 45].В связи с возможной деградацией в процессе производства пищевой продукции содержание бета- каротина, определенное «по закладке», может не соответствовать его действительному содержанию в готовом продукте. Поэтому, чтобы не вводить потребителя в заблуждение, необходимо определять содержание бета-каротина в пищевой продукции с использованием аналитических методов. Наиболееизучены методы определения каротиноидов в растительном сырье. Для их идентификации и количественного определения применяют методы спектрофотометрии, тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии [7, 9, 10, 16, 20, 21, 26–29, 36,37, 42–44, 46]. Несмотря на большой объем работ, посвященных изучению свойств каротиноидов и методам их анализа, вопросы определения бета- каротина в комплексных пищевых добавках изучены недостаточно. Мультифункциональный состав комплексных добавок и наличие ингредиентов, обладающих сорбционными и эмульгирующими свойствами, затрудняют количественное определение каротиноидов. Отсутствие информации о качественном и количественном составе комплексных пищевых добавок приводит к необходимости оптимизации или даже разработки нового способа для анализа каждого пищевого матрикса. Действующие национальный ГОСТ Р 54058 и межгосударственный ГOCT EN 12823-2 не распространяются на комплексные пищевые добавки. Поэтому исследование способов анализа пищевых матриксов, в состав которых входят каротиноиды, а именно наиболее часто применяемый в пищевых производствах бета-каротин, является актуальной задачей.Целью работы является разработка способа экстракции бета-каротина из комплексных пищевых добавок для его идентификации и количественного определения. Объекты и методы исследованияВ работе были использованы химически чистые и особо чистые реактивы, рабочие стандартные образцы (РСО), кристаллический синтетический бета-каротин (Sigma-Aldrich, код 4582), биксин Е160b, ликопин Е160d, бета-апокаротиналь Е160е, лютеин Е161b (Allied Biotech Co.) с содержанием красящих веществ, соответствующих требованиям ТР ТС 029/2012. Также коммерческие образцы комплексных пищевых добавок в виде жидких водорастворимых и диспергируемых в воде и маслах эмульсий и сухих порошков с содержанием бета-каротина от 1 до 10 %. Состав комплексных пищевых добавок, по данным производителей, приведен в таблице 2.Выделение бета-каротина из образцов проводили в защищенном от света месте при температуре 25 ± 2 °С в течение 30 мин при перемешивании стеклянной палочкой (СП) или на термостатированной перемешивающей установке УВМТ-12-250 (ТПУ) со скоростью вращения 120 об/мин, или в ультразвуковой ванне (УЗ) «Sonorex DK 255 P» с частотой ультразвука 35 кГц и мощностью 128 Вт.Для определения бета-каротина в жидких образцах к 0,1 г анализируемой пробы, взвешенной с точностью до 0,001 г, добавляли от 30 до 60 см3 растворителя.Rudometova N.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 2, pp. 374–386 Таблица 2. Состав образцов комплексных пищевых добавокTable 2. Composition of complex food additives НаименованиеВидСоставпищевые добавкибета-каротин Е160а, %Аквабетин 0151Вжидкий, вододиспергируемыйЕ433, Е422, Е322, Е415, Е307, Е2021,5Аквабетин 0200Вжидкий, вододиспергируемыйЕ433, Е422, Е322, Е415, Е307, Е2022,0Бета-каротин 1 % натуральный водорастворимыйжидкий, водорастворимыйЕ433, Е300, Е3861,0Бета-каротин 2 % натуральный водорастворимыйжидкий, водорастворимыйЕ433, Е300, Е3862,0Бета-каротин 3 % натуральный водорастворимыйжидкий, водорастворимыйЕ433, Е300, Е3863,0Натуральный краситель порошкообразный Бетанат 10 % CWDC/0сухой, жирорастворимый–10,0Пищевой краситель Е160асухой, жирорастворимыйЕ494, Е30710,0Бета-каротин Beadlet 10 % CWS-OSсухой жирорастворимыйЕ1450, Е30710,0Натуральный Бета-каротин 10 % Nutrexсухой, вододиспергируемыйЕ307с, Е30410,0Бета-каротин 1 % P-WS Е160асухой, водорастворимыйЕ414, Е420, Е300, Е307, Е5511,0 Пробы перемешивали до достижения однородного состояния, после чего определяли массовую долю бета-каротина. В качестве растворителей использовали: хлороформ, петролейный эфир, циклогексан, гексан, ацетон, этиловый спирт квалификации не ниже х. ч., а также смеси этих растворителей.Выделение бета-каротина из сухих образцов проводили двумя способами. При первом способе к 0,1 г анализируемой пробы, взвешенной с точностью до 0,001 г, добавляли 30 см3 экстрагента, перемешивали до полного растворения или диспергирования пробы, после чего определяли массовую долю бета-каротина. При втором способе к 0,1 г анализируемой пробы, взвешенной с точностью до 0,001 г, добавляли10 см3 дистиллированной воды, затем этанол, хлороформ и перемешивали смесь в течение 10 мин. Затем экстракты переносили в делительную воронку.После отстаивания и разделения фаз отделяли нижний хлороформный слой и повторяли экстракцию, добавляя к водной фазе этанол и хлороформ.Выделение бета-каротина из сухих образцов проводили до полного обесцвечивания водной фазы. Хлороформные экстракты объединяли. Суммарное время экстракции не превышало 1 ч. Для подтверждения стабильности бета-каротина в процессе анализа проводили измерения содержания бета-каротина в 1 % растворе рабочего стандартного образца в хлороформе в начале и в конце процесса экстракции.Содержание бета-каротина в полученных свежеприготовленных растворах и экстрактах определяли по [19] спектрофотометрическим методом, в соответствии с данными таблицы 1, на двулучевом сканирующем спектрофотометре Таблица 3. Условия идентификации каротиноидов методом ВЭТСХTable 3. Conditions for HPTLC of carotenoids КрасительЗначения Rf РСО красителей при разделении в элюентахгексан:бензол (9,7:0,3)бутанол:метилэтилкетон:аммиак 10 % (9:6:6)петролейный эфир:бензол:ацетон:уксусная кислота (23,3:5,8:0,6:0,3)Е160а (i)0,26 ± 0,030,89 ± 0,030,89 ± 0,02Е160b–0,35 ± 0,03–Е160d000,83 ± 0,030,86 ± 0,030,53 ± 0,03Е160е00,81 ± 0,050,40 ± 0,03Е160j00,83 ± 0,050,32 ± 0,03Е161b–0,33 ± 0,05–Рудометова Н. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 2 С. 374–386  Оптическая плотность 0,8 0,6 0,4 0,2 0 350 400 450 500 550 600Длина волны, нмхлороформ циклогексан ацетон Рисунок 2. Спектры РСО бета-каротина в различных растворителяхИдентификацию проводили на силикагелевых пластинах с полимерной подложкой «Sorbfil» ПТСХ-П-В размером 10×10 см в хроматографической камере и в защищенном от света месте. Для приготовления подвижной фазы необходимые объемы компонентов дозировали в колбу объемом 50 см3, закрывали пробкой, перемешивали и вносили в хроматографическую камеру в количестве, которое необходимо для погружения хроматографической пластины на глубину не более 0,5 см от нижнего края. Время насыщения камеры парами элюентов составляло 60 мин. Пробу наносили микрошприцом МШ-10. Объем наносимой пробы 10 мкл. В качестве рабочих стандартных образцов использовали растворы РСО каротиноидов в хлороформе с концентрацией 0,5 ± 1,5 мг/см3.Математическую обработку экспериментальныхFigure 2. Spectra of beta-carotene in various solvents «SHIMADZU UV-1800» (Япония) в диапазоне длин волн 300–700 нм против растворителя. Эффективность экстракции оценивали путем сопоставления значений содержания бета-каротина в экстрактах с его исходным содержанием, заявленным производителем.Для идентификации бета-каротина были подобраны условия высокоэффективной тонко- слойной хроматографии (ВЭТСХ). При них происходит разделение РСО пищевых красителей каротиноидной природы, оцениваемое по величине Rf,с получением компактных пятен на пластине (табл. 3).данных проводили в программах Microsoft Excel 2013. Все измерения проводили в трех повторностях. Доверительные интервалы рассчитывали для доверительной вероятности P = 95 %. Абсолютная погрешность определения не превышает 10 %. Результаты и их обсуждениеПо результатам спектрофотометрического определения каротиноидов в различных растворителях (табл. 1, рис. 2) можно сделать вывод, что вид растворителя незначительно влияет на характер спектров и положение максимумов светопоглощения бета-каротина.Неполярные реагенты, такие как хлороформ, ацетон и гексан, являются хорошими растворителями для Таблица 4. Результаты определения бета-каротина в коммерческих образцах жидких комплексных пищевых добавокTable 4. Beta-carotene in commercial samples of liquid complex food additives ОбразецРастворительПеремешивающее устройствоСодержание бета-каротина(от заявленного производителем), %Аквабетин 0151В Аквабетин 0200ВхлороформСП0ТПУ30 ± 3УЗ96 ± 5хлороформ:ацетон 1:1УЗ95 ± 5ацетон:гексан 1:1УЗ96 ± 5ацетон:петролейный эфир 1:1УЗ97 ± 5Бета-каротин 1 % натуральный водорастворимыйхлороформСП0ТПУ25 ± 3УЗ98 ± 5Бета-каротин 2 % натуральный водорастворимыйхлороформСП0ТПУ30 ± 3УЗ98 ± 5Бета-каротин 3 % натуральный водорастворимыйхлороформСП0ТПУ28 ± 3УЗ98 ± 5Rudometova N.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 2, pp. 374–386 Степень экстракции, % 90 60 30 0Бетанат 10 % CWDC/0 Краситель Е160а Beadlet 10 % CWS-OS 1 2 Бета- каротин 10 %Nutrex Бета- каротин1 % P-WS Рисунок 3. Влияние состава экстрагента на степень экстракции бета-каротина из водных растворов сухих образцов комплексных пищевых добавок: 1 – этанол:хлороформ v/v 3:4; 2 – этанол:хлороформ v/v 1:2Figure 3. Effect of the extractant composition on the degree of beta-carotene extraction from aqueous solutions of dry complex food additives: 1 – ethanol:chloroform, v/v 3:4; 2 – ethanol:chloroform, v/v 1:2 гидрофобного бета-каротина. Однако эксперименты показали, что жидкие эмульсионные образцы плохо смешиваются с хлороформом и циклогексаном при простом перемешивании стеклянной палочкой. Увеличение интенсивности перемешивания при использовании ТПУ приводило к образованию стойких непрозрачных эмульсий. Это затрудняло последующее количественное определение бета-каротина. Полное растворение образцов в хлороформе было достигнуто при УЗ-воздействии. Это можно объяснить нарушением межмолекулярных взаимодействий УЗ-волнами, приводящим к разрушению эмульсии и ускорению растворения образца.Добавка к неполярному растворителю полярного, который способен образовывать водородные связи, приводит к нарушению гидрофильно- липофильного баланса и разрушению эмульсии. Поэтому для экстракции из жидких эмульсионных образцов были апробированы бинарные системы на основе неполярного и полярного растворителей: ацетон:хлороформ, ацетон:гексан, ацетон:петролейный эфир в объемных соотношениях 1:1. Полученные результаты (табл. 4) показали, что при УЗ-воздействии бета-каротин экстрагируется как хлороформом, так и в бинарными экстрагентами, а его Таблица 5. Экспериментальные данные по экстракции бета-каротина из коммерческих образцов сухих комплексных пищевых добавокTable 5. Extraction of beta-carotene from commercial samples of dry complex food additives ОбразецПараметры экстракцииБета-каротин (от заявлен- ного), %РастворительСостав экстрагента, см3Переме- шиваниеКратность экстракцииводахлоро-формацетонэтанолпетролейный эфирНатуральный краситель порошкообразный Бетанат 10 % CWDC/0–30–––СП, ТПУ, УЗ10––15–15СП, ТПУ, УЗ3201040–30–ТПУ4951020–10–ТПУ498Пищевой краситель Е160а–30–––ТПУ4751040–30–ТПУ3981020–10–ТПУ399Бета-каротин Beadlet 10 % CWS-OS–30–––УЗ, ТПУ10––15–15СП, ТПУ3401040–30–ТПУ3401020–10–ТПУ497Натуральный Бета- каротин 10 % Nutrex–30–––УЗ, ТПУ101020–30–ТПУ4951020–10–ТПУ499Бета-каротин 1 %P-WS Е160а–30–––УЗ, ТПУ4171040–30–ТПУ4981020–10–ТПУ498Рудометова Н. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2021. Т. 51. № 2 С. 374–386 Таблица 6. Максимумы поглощения хлороформных извлечений, полученных при экстракции бета-каротина из водных растворов образцов сухих комплексных пищевых добавок с использованием бинарного экстрагента этанол:хлороформ v/v 1:2Table 6. Maximum absorption of chloroform extracts obtained by extraction of beta-carotene from aqueous solutionsof dry complex food additives using a binary extractant of ethanol:chloroform, v/v 1: 2 Образецλmax, нмНатуральный краситель порошкообразный Бетанат 10 % CWDC/0461 ± 1Пищевой краситель Е160а461 ± 1Бета-каротин Beadlet 10 % CWS-OS461 ± 1Натуральный Бета-каротин 10 % Nutrex460 ± 1Бета-каротин 1 % P-WS Е160а460 ± 1 содержание соответствует значениям, заявленным производителями.При экстракции из сухих образцов (табл. 5) с использованием хлороформа и бинарного экстрагента ацетон:петролейный эфир, показавших лучшие результаты для жидких образцов, бета-каротин не извлекался или извлекался не полностью. При этом УЗ-воздействие не способствовало эффективному диспергированию сухих образцов, в отличие от ТПУ, из-за недостаточного кавитационного воздействия. Поэтому было предложено предварительно диспергировать образцы в воде и проводить экстракцию хлороформом в условиях интенсивного перемешивания. В качестве сорастворителя, проявляющего солюбилизирующие свойства, использовали этиловый спирт. Предлагаемый способ позволил практически полностью выделить бета-каротин из сухих образцов различного компонентного состава. Лучшие результаты достигнуты при добавлении к одному объему водного раствора сухого образца трех объемов бинарного экстрагента этанол:хлороформ с объемным соотношением 1:2 (рис. 3).Результаты спектрофотометрического анализа (табл. 6) показали соответствие спектров красителя, выделенного из коммерческих образцов, спектрам РСО бета-каротина. Максимумы поглощения соответствуют характеристической длине волны бета-каротина в хлороформе.Идентификация бета-каротина, в выбранных по результатам предварительного тестирования трех подвижных фаз (табл. 3), подтвердила результаты спектрофотометрического анализа: Rf пятен всехобразцов соответствует Rf пятнам РСО бета-каротина,другие каротиноиды не обнаружены. На рисунке5 в качестве примера представлены результаты ВЭТСХ экстрактов, полученных из образцов сухих комплексных пищевых добавок при разделении  Рисунок 4. Результаты ВЭТСХ идентификации бета- каротина на пластине Sorbfil ПТСХ-П-В в элюенте гексан:бензол (v/v 9,7:0,3): 1 – РСО бета-каротина; 2 – Бетанат 10 % CWDC/0; 3 – Краситель Е160а;4 – Beadlet 10 % CWS-OS; 5 – Бета-каротин 10 % Nutrex; 6 – Бета-каротин 1 % P-WS Е160аFigure 4. HPTLC identification of beta-carotene using a Sorbfil PTSKh-P-V plate in hexane:benzene (v/v 9.7:0.3): 1 – beta- carotene; 2 – Betanate 10% CWDC/0; 3 – E160a; 4 – Beadlet 10%CWS-OS; 5 – Beta-carotene 10% Nutrex; 6 – Beta-carotene 1%P-WS Е160а в элюенте гексан:бензол с объемным соотноше- нием 9,7:0,3.В результате проведенных экспериментов установлены условия и разработан способ подготовки проб для идентификации и определения содержания бета-каротина в комплексных пищевых добавках. ВыводыПоказана эффективность ультразвукового воздействия на выделение бета-каротина из жидких комплексных пищевых добавок различного состава. Максимальная степень извлечения бета-каротина (не менее 95 %) из жидких эмульсионных систем достигается при использовании хлороформа и дополнительного ультразвукового воздействия, которое способствует разрушению эмульсионной системы. При экстракции бета-каротина из сухих образцов предложено предварительно диспергировать образцы в воде в условиях интенсивного перемешивания. Наиболее эффективной признана бинарная экстракционная система с объемным соотношением этанол:хлороформ 1:2. При ее использовании степеньэкстракции бета-каротина достигает 98 %.Спектрофотометрический и хроматографический анализ подтвердил отсутствие деградации бета-Rudometova N.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2021, vol. 51, no. 2, pp. 374–386 каротина в процессе подготовки проб к анализу по разработанному способу.Для идентификации бета-каротина в пищевых добавках рекомендованы элюцион- ные системы гексан:бензол (9,7:0,3), бута- нол:метилэтилкетон:аммиак 10 % (9:6:6) и петролейныйэфир:бензол:ацетон:уксусная кислота (23,3:5,8:0,6:0,3). Разработанный способ экстракции может быть рекомендован как способ подготовки проб комплексных пищевых добавок для определения в них бета-каротина в целях осуществления контроляего использования. Критерии авторстваН. В. Рудометова – руководство исследованиями, литературный обзор, анализ экспериментальных данных, написание и общая редакция рукописи.К. Е. Кулишова – проведение экспериментальных исследований, обработка и анализ полученных данных. Конфликт интересовАвторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. ContributionN.V. Rudometova supervised the research, reviewed the related scientific publications, analyzed the experimental data, and wrote and proofread the manuscript.K.E. Kulishova performed the experimental research, as well as processed and analyzed the obtained data. Conflict of interestThe authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this article.