Food Processing: Techniques and Technology Food Processing: Techniques and Technology Техника и технология пищевых производств 2074-9414 2313-1748 41366 10.21603/2074-9414-2020-4-726-735 ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ ORIGINAL ARTICLE ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ Casein Proteolysis in Bioactive Peptide Production: Optimal Operating Parameters Подбор рабочих параметров для проведения направленного протеолиза казеина с целью получения биопептидов https://orcid.org/0000-0002-3536-562X Милентьева Ирина Сергеевна Milentyeva Irina S. irazumnikova@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-2479-8750 Давыденко Наталия Ивановна Davydenko Nataliia I. nat1861@yandex.ru Расщепкин Александр Николаевич Rasshchepkin Aleksandr N.

доктор технических наук;

doctor of technical sciences;

 Кемеровский государственный университет Кемерово Россия Kemerovo State University Kemerovo Russian Federation Кемеровский государственный университет Кемерово Россия Kemerovo State University Kemerovo Russian Federation Кемеровский государственный университет Кемерово Россия Kemerovo State University Kemerovo Russian Federation 50 4 726 735 http://fptt.ru/eng/?page=archive&jrn=59&article=14

Введение. На сегодняшний день наблюдается значительное ухудшение здоровья населения, связанное с образом жизни. Одним из признаков такого ухудшения является возникновение аллергических реакций на определённые компоненты пищи. Молоко и молочные продукты, благодаря содержанию биологически активных веществ, относятся к функциональным продуктам питания, систематического употребление которых способствует улучшению здоровья населения. Наличие аллергенов в молоке (сывороточные и молочные белки, в особенности казеин, молочный сахар) может нанести вред людям, имеющим аллергическую реакцию на перечисленные компоненты. Поэтому актуальной задачей является снижение аллергенных свойств казеинов. Цель работы заключается в осуществлении подбора рабочих параметров протеолиза казеина рядом ферментов – эндопептидаз, а именно трипсином, химотрипсином, термолизином, для получения биопептидов из казеина путем варьирования параметров гидролиза. Объекты и методы исследования. Гидролизаты казеина – биопептиды, исходным сырьем (субстратом) для которых являлся доступный и ценный белок молока – пищевой казеин. В качестве протеаз были использованы следующие ферменты: трипсин, химотрипсин и термолизин. В работе применялись общепринятые методы. Результаты и их обсуждение. В ходе проведения гидролиза при температуре 37 ± 2 °С и с использованием различных параметров (фермент, соотношение фермент-субстрата, продолжительность гидролиза) было установлено, что рабочие значения активной кислотности (рН) находились от 7,05 ± 0,2 до 7,44 ± 0,2. Также при увеличении времени протеолиза увеличивается количество свободных аминокислот. Для получения гидролизованных смесей, содержащих пептиды молекулярной массой менее 18 кДа, рационально использовать термолизин при соотношении 1:100 в течение 24,00 ± 0,05 ч, химотрипсин и трипсин при соотношении 1:25 в течение 24,00 ± 0,05 ч. Для получения гидролизата, содержащего большое количество аминокислот, необходимо использовать при протеолизе химотрипсин при соотношении фермент-субстрат 1:25 в течение 24 ч или термолизин при соотношении 1:100. Выводы. Полученные гидролизаты казеина, содержащие биопептиды, которые являются гипоаллергенными, в сравнении с исходным казеином, в дальнейшем могут использоваться при изготовлении специализированной молочной продукции для диетического, спортивного и детского питания.

Introduction. Public health is gradually deteriorating as a result of unhealthy lifestyle and diet, which triggers allergic reaction to certain foods. Milk and dairy products are rich in biologically active substances, which makes them a good dietary supplement for athletes, diabetic patients, etc. However, this popular food contains allergens, for instance, such proteins as αS1-casein, αS2-casein, β-casein, and κ-casein. Therefore, one of the most urgent tasks of modern food science is to reduce the allergenic properties of casein. Heat treatment is an option, but thermal exposure leads to denaturation and produces new antigenic determinants, e.g. epitopes. Biotechnological processing is a more promising method. It is based on the catalytic properties of proteolytic enzymes. Enzymes make it possible to obtain a protein hydrolyzate with amino acids of various molecular weights. The present research provided the optimal working parameters of casein proteolysis by various enzymes (endopectidases), namely trypsin, chymotrypsin, and thermolysin. Study objects and methods. Casein hydrolysates are casein-based biopeptides, and casein is an accessible and valuable milk protein. Trypsin, chymotrypsin, and thermolysin were used as proteases. The experiment was based on standard methods. Results and its discussion. At 47 ± 2°C and pH 7.5 ± 0.2, the production of low-molecular-weight components of casein hydrolyzate proved feasible when thermolysin was used at a ratio of 1:100 for 24.00 ± 0.05 h, and chymotrypsin and trypsin – at a ratio of 1:25 for 24.00 ± 0.05 h. Conclusion. The resulting casein hydrolysates contain biologically active peptides and can be used in formulations of low-allergy functional dairy products in allergy-friendly, sports, and baby diets.

 Гидролиз протеолиз казеин белки пептиды аминокислоты трипсин химотрипсин термолизин аллергия Hydrolysis proteolysis casein proteins peptides amino acids trypsin chymotrypsin thermolysin allergy Работа выполнена в рамках гранта Президента РФ по государственной поддержке ведущих научных школ (НШ-2694.2020.4). This research was part of the grant of the President of the Russian Federation for state support of leading scientific schools (NSh-2694.2020.4).

ВведениеПитание является основной жизненнойпотребностью человека, способной влиять наздоровье организма. В связи со снижениемкачества питания (недостаточным содержаниемвитаминов и минералов, избыточным содержаниежиров и углеводов в пище и т. п.) ухудшаетсясостояние здоровья: высок риск развития нетолько алиментарных заболеваний, но и болезнейобраза жизни (сахарного диабета, сердечно-сосудистых заболеваний, ожирения и т. п.) [1, 2].Профилактической мерой данных негативныхпоследствий является систематическое употреблениепищевых продуктов, богатых основныминутриентами. Например, систематическое употребле-ние продуктов молочной промышленности,обладающих высокой биологической ценностьюиз-за содержания незаменимых жирных кислот,аминокислот, витаминов, макроэлементов (кальция)и т. д. [3, 4]. Но не все потребители могут получатьпользу от молока и молочных продуктов. Причинойявляется возникновение аллергии или пищевойнепереносимости, заданной генетическими особен-ностями организма, на компоненты молока [5].Например, на молочный сахар и/или белки молока.Коровье молоко содержит 25 видов различныхбелков, среди которых основным аллергеномявляется казеин, т. к. на данный кальций-связывающий фосфопротеин приходится 80 % отобщего содержания белков [6]. Фракция казеинапредставлена четырьмя видами белков (рис. 1):αS1-казеин, αS2-казеин, β-казеин и κ-казеин.Причем αS1-казеин является наиболее важнымаллергеном [7].На сегодняшний день нет терапии илилекарственных средств (без побочных эффектов)по устранению аллергии на компоненты молока.Единственный доступный способ – это исключениемолочных продуктов из рациона питания. Однакоданное решение негативно скажется на здоровьечеловека, т. к. приведет к дефициту важныхпитательных веществ, содержащихся в молочныхпродуктах [7].С развитием биотехнологии появились новыеметоды, позволяющие преобразовывать молоков новые полезные продукты питания путемуменьшения аллергенности их компонентов.Наряду с нагреванием (термической обработкой)можно использовать ферментативный гидролизи гликилирование [8]. Так как фракции казеинаустойчивы к нагреванию, т. е. термостабильныРисунок 1. Фракции казеинаи их содержание от общей массы белкаFigure 1. Casein fractions and their content vs. total proteinAbstract.Introduction. Public health is gradually deteriorating as a result of unhealthy lifestyle and diet, which triggers allergic reaction tocertain foods. Milk and dairy products are rich in biologically active substances, which makes them a good dietary supplement forathletes, diabetic patients, etc. However, this popular food contains allergens, for instance, such proteins as αS1-casein, αS2-casein,β-casein, and κ-casein. Therefore, one of the most urgent tasks of modern food science is to reduce the allergenic properties of casein.Heat treatment is an option, but thermal exposure leads to denaturation and produces new antigenic determinants, e.g. epitopes.Biotechnological processing is a more promising method. It is based on the catalytic properties of proteolytic enzymes. Enzymes makeit possible to obtain a protein hydrolyzate with amino acids of various molecular weights. The present research provided the optimalworking parameters of casein proteolysis by various enzymes (endopectidases), namely trypsin, chymotrypsin, and thermolysin.Study objects and methods. Casein hydrolysates are casein-based biopeptides, and casein is an accessible and valuable milk protein.Trypsin, chymotrypsin, and thermolysin were used as proteases. The experiment was based on standard methods.Results and its discussion. At 47 ± 2°C and pH 7.5 ± 0.2, the production of low-molecular-weight components of casein hydrolyzateproved feasible when thermolysin was used at a ratio of 1:100 for 24.00 ± 0.05 h, and chymotrypsin and trypsin – at a ratio of 1:25 for24.00 ± 0.05 h.Conclusion. The resulting casein hydrolysates contain biologically active peptides and can be used in formulations of low-allergyfunctional dairy products in allergy-friendly, sports, and baby diets.Keywords. Hydrolysis, proteolysis, casein, proteins, peptides, amino acids, trypsin, chymotrypsin, thermolysin, allergyFunding. This research was part of the grant of the President of the Russian Federation for state support of leading scientific schools(NSh-2694.2020.4).For citation: Milentyeva IS, Davydenko NI, Rasshchepkin AN. Casein Proteolysis in Bioactive Peptide Production: OptimalOperating Parameters. Food Processing: Techniques and Technology. 2020;50(4):726–735. (In Russ.). https://doi.org/10.21603/2074-9414-2020-4-726-735.40 %10 %35 %15 %αS1-казеин αS2-казеин β-казеин κ-казеин728Milentyeva I.S. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 4, pp. 726–735при нагревании до 50 °С, но восприимчивы кферментативной активности, то эффективнымметодом снижения аллергенности данныхсоединений является ферментный гидролиз [6].Под ферментным гидролизом (протеолизом)подразумевается процесс разложения белковна составляющие пептиды и аминокислотыпутем воздействия соответствующих ферментов(протеаз или протеолитических ферментов) [9].При проведении ферментного гидролиза казеинаможно получать гипоаллергенные гидролизованныемолочные смеси (гидролизаты казеина), содержащиебиоактивные пептидные комплексы [10].Протеолиз имеет ряд закономерностей, связанныхс различными факторами (с коллоидными, фазовыми,биохимическими процессами), которые не всегдаприводят к получению необходимого продукта. Ктому же гидролиз может иметь обратимый характер,когда дезагрегация белка не зашла слишком далеко.Иными словами, для получения биоактивныхпептидов необходимо добиться оптимальной степенигидролиза. Для этого следует подобрать эффективныепараметры (рН, температура, время) и фермент(соотношение фермент-субстрата). Для проведенияферментного гидролиза в основном используютследующие ферменты:Экзопептидазы, которые катализируют разрывконцевой пептидной связи. Например, карбокси-пептидазы А и В, аланинаминопептидаза, лейцина-минопептидаза;Эндопептидазы, которые катализируют разрывпептидных связей внутри цепи. Например, пепсин,трипсин, химотрипсин, термолизин и эластаза [11].Для проведения протеолиза можно использоватьследующие ферменты:1) Трипсин – фермент, полученный изподжелудочной железы свиньи. Он легко расщепляетпептидные связи, в образовании которых учувствуюткарбоксильные группы лизина или аргинина. Данныйфермент осуществляет неглубокий гидролиз белков– расщепляет около одной трети всех пептидныхсвязей [12];2) Химотрипсин – фермент, полученный изподжелудочной железы свиньи, расщепляющий тесвязи, которые не расщепляет трипсин. В связи с этимпоследовательное применение данных ферментовпозволяет провести глубокий гидролиз [13];3) Термолизин – фермент, полученный приметаболизме Bacillus thermoproteolyticus, способныйрасщеплять пептидные связи, образованныеостатками лейцина, изолейцина, валина, аланина ифенилаланина [12].Полученные гидролизаты в дальнейшемможно использовать в качестве компонентовспециализированных пищевых продуктов молочнойпромышленности – функциональных продуктовпитания для поддержания здорового состоянияорганизма, т. е. для спортивного, диетического идетского питания [14].Цель работы заключается в подборе рабочихпараметров для получения гидролизатов казеина –биопептидов, обладающих меньшей аллергенностью,чем исходный белок, путем варьирования пара-метров гидролиза (соотношения фермент-субстрат,температура, продолжительность и рН гидролиза)при использовании эндопептидаз (трипсина,химотрипсина и термолизина).Объекты и методы исследованияОбъектом исследования являлись гидролизатыказеина – биопептиды. Исходным сырьем(субстратом) для них являлся доступный и ценныйбелок молока – пищевой казеин (Pronadisa Conda,Испания), соответствующий ГОСТ 31689-2012.В качестве протеаз были использованыследующие ферменты, выбранные у зарубежныхпоставщиков в связи с отсутствием на российскомрынке данных ферментов в чистом виде: трипсин(Gibco (Thermo Scientific), США), химотрипсин(AppliChem, США) и термолизин (Gibco (ThermoScientific), США).Проведение протеолиза осуществляли с помощьюстатического метода. Методика представлена вработе О. В. Козловой и ее коллег [15]. Растворказеина (10 мг белка на 1 мл дистиллированной воды)гидролизовали путем добавления в смесь фермента втрех разных соотношениях: 1:25, 1:50, 1:100 [16]. Входе анализа научной литературы по данной тематикебыли подобраны оптимальные параметры гидролизаказеина представленными выше ферментами. Врезультате чего гидролиз протекал при температурев 37 ± 2 °С [17]. Значение рН смеси регулировалидобавлением 0,1 М HCl или NaOH в соответствиис оптимальной рН для каждого фермента. Длятрипсина, химотипсина и термолизина оптимальноезначение рН составляет от 7,0 ± 0,2 до 8,0 ± 0,2 [18].Оценка степени гидролиза определялась посодержанию общего азота. Методика определенияпредставлена в ГОСТ 23327-98. Установлениемолекулярной массы компонентов гидролизатаосуществлялось с помощью электрофореза по Лэм-мли в полиакриламидном геле (ПААГ) [18, 19].Для гидролизатов, полученных при выбранныхрабочих условиях (соотношение фермент-субстрат для каждой протеазы и оптимальнаяпродолжительность гидролиза), осуществляласьоценка аминокислотного состава. Даннаяпроверка выполнялась при помощи ионообменнойхроматографии на аминокислотном анализаторе«ARACUS» [20].Результаты и их обсуждениеИзучение влияния соотношения фермент-субстрат и времени на протекание протеолиза.Оптимальный протеолиз казеина оценивали при729Милентьева И. С. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 4 С. 726–735различных соотношениях фермент-субстрата втечение 6, 12 и 24 ч. Результаты серии экспериментов,связанных с подбором оптимального соотношенияфермент-субстрата при протеолизе, представлены втаблице 1.Было определено, что величина рН припротеолизе различными ферментами в течение6, 12 и 24 ч находится в пределах от 7,05 ± 0,2 до7,44 ± 0,2, что находится в пределах оптимальнойработы ферментов. Следовательно, такие значенияявляются рабочими.Анализируя данные из таблицы 1, видно, что прифермент-субстратном соотношении 1:25 выбранныхферментов наблюдается следующая активностьгидролиза. При использовании трипсина через6,00 ± 0,05 ч степень гидролиза была более 2,80 %,через 12,00 ± 0,05 ч – более 5,00 %, через 24,00 ± 0,05 ч– более 11,00 %. Степень активности гидролизапри применении химотрипсина через 6,00 ± 0,05 чсоставила более 1,70 %, через 12,00 ± 0,05 ч – более5,00 %, а через 24,00 ± 0,05 ч – более 8,30 %. Прииспользовании термолизина степень гидролизапри фермент-субстратном соотношении 1:25 через6,00 ± 0,05 ч была более 1,50 %, через 12,00 ± 0,05 ч– 2,60 %, а через 24,00 ± 0,05 ч – 6,50 %.При соотношении фермент-субстрат 1:50 степеньактивности гидролиза для каждого ферментавыглядит следующим образом. Через 6,00 ± 0,05 чприменения трипсина степень гидролиза былаболее 5,50 %, через 12,00 ± 0,05 ч – 9,70 %, через24,00 ± 0,05 ч – 12,00 %. Степень активностигидролиза при применении химотрипсина через6,00 ± 0,05 ч составила более 6,00 %, через12,00 ± 0,05 ч – 10,20 %, а через 24,00 ± 0,05 ч –11,00 %. При использовании термолизина выявлено,что степень активности гидролиза стала более 4,90 %через 6,00 ± 0,05 ч, 7,00 % через 12,00 ± 0,05 ч, 6,40 %через 24,00 ± 0,05 ч.Из таблицы 1 видно, что при использованиивыбранных ферментов в соотношении 1:100наблюдается следующая активность гидролиза. Приприменении трипсина через 6,00 ± 0,05 ч степеньактивности гидролиза была более 7,60 %, через12,00 ± 0,05 ч – 12,40 %, через 24,00 ± 0,05 ч – 16,00 %.Степень активности гидролиза при использованиихимотрипсина составила более 8,80 % через 6,00 ±0,05 ч, через 12,00 ± 0,05 ч – 10,50 %, а через 24,00 ±0,05 ч – 14,60 %. При соотношении фермент-субстрата1:100 степень гидролиза при применении термолизиначерез 6,00 ± 0,05 ч была более 6,40 %, через 12,00 ±0,05 ч – 10,50 %, а через 24,00 ± 0,05 ч – 14,50 %.В результате эксперимента по подборуоптимального соотношения фермент-субстратавыявлено, что чем дольше протекает гидролиз,тем выше степень гидролиза. Но, если сравниватьдействие ферментов, то при соотношении1:25 наибольшей активностью при гидролизе,протекающем в течение 6 ч, обладал трипсин, пригидролизе в 12 ч – химотрипсин, при 24 ч – трипсин.При соотношении 1:50 наибольшей активностьюпри гидролизе, протекающем в течение 6 ч, обладалхимотрипсин, при гидролизе в 12 ч – химотрипсин,при 24 ч – термолизин. При соотношении1:100 наибольшей активностью при гидролизе,протекающем в течение 6 ч, обладал химотрипсин,при гидролизе в 12 ч – трипсин, при 24 ч – трипсин.Изучение молекулярно-массового распределенияобразовавшихся пептидов в зависимости от соотно-шения фермент-субстрат и времени протеканияпротеолиза. Результаты исследования составафракций гидролизатов казеина, образовавшихсяпод действием выбранных ферментов, а именномолекулярно-массовое распределение получившихсяпептидов, представлены в таблицах 2–4. Важно, чтоТаблица 1. Основные характеристики гидролизатовказеина, полученных в результате обработки белкапротеолитическими ферментамиTable 1. Casein hydrolysates obtained by processing protein withproteolytic enzymesПоказательКонтрольФермент-субстратное соотношениепри продолжительности гидролиза, ч1:25 1:50 1:1006,00 ± 0,0512,00 ± 0,0524,00 ± 0,056,00 ± 0,0512,00 ± 0,0524,00 ± 0,056,00 ± 0,0512,00 ± 0,0524,00 ± 0,05ТрипсинСтепеньпротеолиза,%02,80 ± 0,204,80 ± 0,3010,60 ± 0,705,50 ± 0,409,70 ± 0,7012,00 ± 0,807,60 ± 0,5012,40 ± 0,9016,00 ± 1,10рН7,50 ± 0,27,33 ± 0,27,22 ± 0,27,15 ± 0,27,36 ± 0,27,32 ± 0,27,27 ± 0,27,40 ± 0,27,38 ± 0,27,26 ± 0,2ХимотрипсинСтепеньпротеолиза,%01,70 ± 0,105,00 ± 0,408,30 ± 0,606,00 ± 0,4010,20 ± 0,7011,00 ± 0,808,80 ± 0,6010,50 ± 0,7014,60 ± 1,00рН7,50 ± 0,27,11 ± 0,27,20 ± 0,27,05 ± 0,27,47 ± 0,27,31 ± 0,27,22 ± 0,27,28 ± 0,27,32 ± 0,27,28 ± 0,2ТермолизинСтепеньпротеолиза,%01,50 ± 0,102,60 ± 0,206,50 ± 0,404,90 ± 0,307,00 ± 0,5012,50 ± 0,906,40 ± 0,4010,50 ± 0,7014,50 ± 1,00рН7,50 ± 0,27,44 ± 0,27,29 ± 0,27,26 ± 0,27,41 ± 0,27,37 ± 0,27,30 ± 0,27,42 ± 0,27,35 ± 0,27,31 ± 0,2730Milentyeva I.S. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 4, pp. 726–735нативный казеин с молекулярной массой в 28 кДаявлялся контролем.Из таблицы 2 видно, что в процессе протеолизаоптимальное время, за которое образуется большееколичество наименьших фракций (молекуляроймассой менее 18 кДа), – 12,00 ± 0,05 ч длясоотношения фермент-субстрат 1:25 и 1:50. Приданном времени в соотношении 1:25 в составгидролизата входят пептиды с молекулярноймассой от менее 18,0 до 25,0 кДа, при соотношении1:50 – от 20,0 до 25,0 кДа, а при 1:100 – от 25,0 до30,0 кДа. Наибольшее количество низкомоле-кулярных фракции при 12,00 ± 0,05 ч образуется присоотношении 1:25.Таблица 2 Молекулярно-массовое распределение фракций гидролизатов казеина, полученных при воздействии трипсина, %Table 2. Molecular weight distribution of fractions of casein hydrolysates obtained by trypsin exposure, %Соотношениефермент-субстратПоказательПродолжительностьгидролиза, чДиапазон молекулярных масс, кДа30,0–28,0 28,0–25,0 25,0–20,0 20,0–18,0 Менее 18,01:25 6,00 ± 0,05 3,0 4,3 20,9 25,2 46,012,00 ± 0,05 1,2 3,1 19,7 21,2 52,424,00 ± 0,05 2,5 1,9 19,8 22,0 52,41:50 6,00 ± 0,05 2,2 41,4 8,5 15,0 16,412,00 ± 0,05 3,0 2,4 43,0 8,5 15,424,00 ± 0,05 2,1 35,0 29,7 12,3 18,41:100 6,00 ± 0,05 45,8 8,0 16,1 14,0 2,812,00 ± 0,05 2,9 35,0 8,5 18,6 3,724,00 ± 0,05 22,5 23,8 20,6 19,8 10,0Таблица 3. Молекулярно-массовое распределение фракций гидролизатов казеина,полученных при воздействии химотрипсина, %Table 3. Molecular weight distribution of fractions of casein hydrolysates obtained by chymotrypsin exposure, %Соотношениефермент-субстратПоказательПродолжительностьгидролиза, чДиапазон молекулярных масс, кДа30,0–28,0 28,0–25,0 25,0–20,0 20,0–18,0 Менее 18,01:25 6,00 ± 0,05 2,9 2,6 21,4 22,1 51,012,00 ± 0,05 3,2 2,7 19,8 19,0 52,424,00 ± 0,05 2,1 1,9 19,8 18,0 52,51:50 6,00 ± 0,05 3,1 41,4 8,6 14,8 16,712,00 ± 0,05 2,6 2,9 44,6 8,6 15,024,00 ± 0,05 2,2 35,6 29,6 12,2 18,01:100 6,00 ± 0,05 46,5 7,8 16,4 14,2 2,812,00 ± 0,05 3,4 36,0 8,6 19,0 3,724,00 ± 0,05 22,0 24,5 21,0 19,6 10,3Таблица 4. Молекулярно-массовое распределение фракций гидролизатов казеина, полученныхпри воздействии термолизина, %Table 4. Molecular weight distribution of fractions of casein hydrolysates obtained by thermolysin exposure,%Соотношениефермент-субстратПоказательПродолжительностьгидролиза, чДиапазон молекулярных масс, кДа30,0–28,0 28,0–25,0 25,0–20,0 20,0–18,0 Менее 18,01:25 6,00 ± 0,05 10,9 3,3 46,6 5,6 32,012,00 ± 0,05 12,5 2,5 32,9 9,0 43,124,00 ± 0,05 4,8 23,4 24,6 18,2 29,01:50 6,00 ± 0,05 8,0 14,8 38,7 8,8 29,012,00 ± 0,05 8,4 5,9 47,0 4,7 34,024,00 ± 0,05 17,0 3,2 16,3 20,0 43,61:100 6,00 ± 0,05 3,5 12,9 11,5 17,0 52,312,00 ± 0,05 11,5 2,6 15,0 7,0 36,924,00 ± 0,05 0,0 13,0 16,8 15,6 54,5731Милентьева И. С. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 4 С. 726–735Результаты исследования показывают, чтооптимальное время, за которое образуется большееколичество наименьших фракций, – 24,00 ± 0,05 ч(табл. 2). Для этого времени при соотношении 1:25,при применении химотрипсина, в состав гидролизатавходят пептиды с молекулярной массой от менее18,0 до 25,0 кДа, при соотношении 1:50 – от 20,0 до28,0 кДа, а при 1:100 – от 25,0 до 30,0 кДа.Наибольшее количество низкомолекулярныхфракции при 24,00 ± 0,05 ч образуется присоотношении фермент-субстрат 1:25.Анализ таблицы 4 показал, что оптимальноевремя, за которое образуется большее количествонаименьших фракций, – 12,00 ± 0,05 ч. Для такоговремени при соотношении 1:25 и 1:50 в составгидролизата входят пептиды с молекулярной массойменее 18,0, и от 20,0 и 25,0 кДа, а при 1:100 – менее18 кДа. Наибольшее количество низкомолекулярныхфракции при 12,00 ± 0,05 ч образуется присоотношении 1:100.По результатам распределения видно, чтопри увеличении продолжительности протеолизауменьшается содержание пептидов с молекулярноймассой 30 кДа и увеличивается количествонизкомолекулярных пептидов и аминокислот смолекулярной массой менее 18 кДа. Полученныеданные не противоречат ранее изложеннойинформации, опубликованной отечественными изарубежными ученными [12, 21–24].По результатам экспериментов были подобранооптимальное соотношение фермент-субстрат длякаждой протеазы и оптимальная продолжительностьгидролиза (табл. 5 и 6).Исследование аминокислотного состава получен-ных гидролизатов. Для гидролизатов, полученныхпод действием исследуемых ферментов присоблюдении подобранных рабочих параметров,был определен аминокислотный состав. Результатыисследования представлены в таблице 7.Анализируя данные, представленные в таблице 7,видно, что при увеличении времени протеолизаувеличивается количество свободных аминокислот.Данная зависимость видна на примере использованиятрипсина (соотношение фермент-субстрат 1:25,при 6, 12 и 24 ч) и химотрипсина (но при 12 и 24 ч),т. к. наибольшее количество свободных аминокислотТаблица 5. Оптимальные параметры гидролиза,подобранные экспериментальнона основании степени гидролизаTable 5. Optimal hydrolysis parameters basedon the degree of hydrolysisПродолжите-льностьгидролиза, чСоотношение фермент-субстрат1:25 1:50 1:1006,00 ± 0,05 трипсин химотрипсин химотрипсин12,00 ± 0,05 химотрипсин химотрипсин трипсин24,00 ± 0,05 трипсин термолизин трипсинТаблица 6. Оптимальные параметры гидролиза,подобранные экспериментально на основаниимолекулярно-массового распределенияTable 6. Optimal hydrolysis parameters basedon molecular weight distributionФермент Соотношениефермент-субстратПродолжительностьгидролиза, чТрипсин 1:25 12,00 ± 0,05Химотрипсин 1:25 24,00 ± 0,05Термолизин 1:100 12,00 ± 0,05Таблица 7. Динамика накопления свободных аминокислотв результате гидролиза казеина трипсиномTable 7. Accumulation of free amino acids as a result of caseinhydrolysis by trypsinФермент Трипсин Химотрипсин ТермолизинАминокислоты,мкмоль/лФермент-субстратное соотношение1:25 1:100 1:25 1:50 1:100 1:50 1:100Продолжительность ферментативного гидролиза, ч6,00 ± 0,0512,00 ± 0,0524,00 ± 0,0512,00 ± 0,0524,00 ± 0,0512,00 ± 0,0524,00 ± 0,056,00 ± 0,0512,00 ± 0,056,00 ± 0,0524,00 ± 0,0512,00 ± 0,05Trp0,070,150,220,290,620,140,240,180,350,110,330,52Phe1,221,433,024,454,873,703,902,122,365,065,845,11Leu3,654,526,337,478,674,755,183,193,546,6510,679,23Ile0,320,420,691,122,330,520,950,460,570,974,893,60Thr0,170,270,301,303,240,601,110,500,610,921,780,72Met0,780,921,241,553,442,242,471,421,551,983,402,32Lys0,951,602,114,264,802,374,161,952,393,404,732,88Val0,200,340,531,223,320,400,620,330,410,844,903,82His2,382,593,551,263,273,625,082,022,163,052,853,20Arg0,350,760,852,124,431,412,331,241,422,423,453,01Аla0,500,700,711,553,771,191,650,790,930,193,881,58Ser0,050,090,120,623,860,210,520,180,210,311,100,45Glu0,150,120,791,941,251,301,831,902,192,067,850,33Asp0,030,110,100,130,270,050,070,230,300,191,600,74Cys0,660,791,011,301,411,201,430,881,061,131,251,26Tyr3,213,183,537,257,374,635,452,843,225,937,077,36Gly2,402,653,481,293,340,140,330,230,260,400,951,55Всего17,0920,6428,5839,1260,2628,4737,3220,4623,5335,6166,5447,68732Milentyeva I.S. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 4, pp. 726–735после протеолиза наблюдется при 24,00 ± 0,05 ч.Если выбирать между трипсином и химотрипсином,при одинаковых условиях протекания протеолиза,то наиболее богатым по общему содержаниюаминокислот и по содержанию фенилаланина,треонина, метионина, лизина, гистидина, аргинина,аланина, глутаминовой кислоты, цистеина итирозина является гидролизат, полученный прииспользовании химотрипсина. Но гидролизат,полученный при использовании трипсина, богатглицином и аспарагиновой кислотой. При сравнениисодержания свободных аминокислот, полученныхпротеолизом при соотношении фермент-субстрат1:100 в течение 12 ч, видно, что при использованиитермолизина общее содержание аминокислотвыше, как и содержание фенилаланина, лейцина,изолейцина, метионина, валина, гистидина, аргинина,аспарагиновой кислоты, тирозина и глицина. Нов гидролизате, полученном при использованиитрипсина, содержится больше треонина, лизина,серина, глутаминовой кислоты и цистеина.Так, для детского питания важны следующиенезаменимые аминокислоты: триптофан, лизин,фенилаланин, треонин, валин, метионин, лейцин,изолейцин, гистидин и аргинин. Зная при какихпараметрах гидролиза можно получить максимальноесодержание вышеперечисленных аминокислот,можно создавать функциональные продукты питания,использующиеся в диетологической коррекциидетского питания. Например, для коррекциифункциональных расстройств пищеварения (регурги-таций, колик, запора) [25–27].Помимо уменьшения аллергенности ипитательной роли продукта, гидролизаты казеинаобладают противовоспалительными свойствами, т.к. способны улавливать радикалы и хелатироватьметаллы, выводя их из организма. Следовательно,гидролизаты казеинов являются функциональ-ными продуктами, способными предотвращатьразвитие хронических заболеваний (сердечно-сосудистые заболевания, рак и прочие, вызванныеокислительным стрессом) [12].В результате проведенной работы былиполучены гидролизаты казеина. Для каждого былаопределена степень гидролиза и молекулярно-массовое распределение фракций, по которым былиустановлены оптимальные рабочие параметрыпротеолиза. В дальнейшем для гидролизатов,полученных с помощью выбранных параметров, былопределен аминокислотный состав.ВыводыВ данной работе были проведены исследованияпо подбору рабочих условий для получениягидролизатов казеина для уменьшения аллергенностимолока и молочных продуктов. Исследованияпоказали, что для получения гидролизата,содержащего разнообразное количество аминокислот,необходимо использовать термолизин при соотноше-нии фермент-субстрат 1:50 в течение 24,00 ± 0,05 ч.Для получения наиболее гидролизованных смесей,в которых преобладают пептиды молекулярноймассой менее 18 кДа, рационально использоватьтермолизин при соотношении 1:100 в течение 24,00± 0,05 ч, химотрипсин и трипсин при соотношении1:25 в течение 24,00 ± 0,05 ч. Для получениягидролизата, содержащего большое количествоаминокислот, необходимо использовать припротеолизе химотрипсин при соотношении фермент-субстрат 1:25 в течение 24,00 ± 0,05 ч или термолизинпри соотношении 1:100. Варьируя параметрамипротеолиза, можно получать гидролизованныемолочные продукты с заданным аминокислотнымсоставом, что важно при производстве функциона-льных продуктов питания.Критерии авторстваАвторы в равной степени участвовали в подго-товке и написании статьи.Конфликт интересовАвторы заявляют, что конфликта интересов нет.ContributionAll the authors bear equal responsibility for thecontent of the article.Conflict of interestThe authors declare that there is no conflict of interestregarding the publication of this article.

Prosekov, A. Yu. Providing food security in the existing tendencies of population growth and political and economic instability in the world / A. Yu. Prosekov, S. A. Ivanova // Foods and Raw Materials. - 2016. - Vol. 4, № 2. - Р. 201-211. https://doi.org/10.21179/2308-4057-2016-2-201-211. Prosekov AYu, Ivanova SA. Providing food security in the existing tendencies of population growth and political and economic instability in the world. Foods and Raw Materials. 2016;4(2):201-211. https://doi.org/10.21179/2308-4057-2016-2-201-211. Perspective: advancing understanding of population nutrient-health relations via metabolomics and precision phenotypes / S. Andraos, M. Wake, R. Saffery [et al.] // Advances in Nutrition. - 2019. - Vol. 10, № 6. - Р. 944-952. https://doi.org/10.1093/advances/nmz045. Andraos S, Wake M, Saffery R, Burgner D, Kussmann M, O’Sullivan J. Perspective: advancing understanding of population nutrient-health relations via metabolomics and precision phenotypes. Advances in Nutrition. 2019;10(6):944-952. https://doi.org/10.1093/advances/nmz045. Antioxidant properties of milk and dairy products: a comprehensive review of the current knowledge / I. T. Khan, M. Nadeem, M. Imran [et al.] // Lipids in Health and Disease. - 2019. - Vol. 18, № 1. https://doi.org/10.1186/s12944-019-0969-8. Khan IT, Nadeem M, Imran M, Ullah R, Ajmal M, Jaspal MH. Antioxidant properties of milk and dairy products: a comprehensive review of the current knowledge. Lipids in Health and Disease. 2019;18(1). https://doi.org/10.1186/s12944-019-0969-8. Dairy fats and cardiovascular disease: Do we really need to be concerned? / R. Lordan, A. Tsoupras, B. Mitra [et al.] // Foods. - 2018. - Vol. 7, № 3. https://doi.org/10.3390/foods7030029. Lordan R, Tsoupras A, Mitra B, Zabetakis I. Dairy fats and cardiovascular disease: Do we really need to be concerned? Foods. 2018;7(3). https://doi.org/10.3390/foods7030029. Genes and eating preferences, their roles in personalized nutrition / A. Vesnina, A. Prosekov, O. Kozlova [et al.] // Genes. - 2020. - Vol. 11, № 4. https://doi.org/10.3390/genes11040357. Vesnina A, Prosekov A, Kozlova O, Atuchin V. Genes and eating preferences, their roles in personalized nutrition. Genes. 2020;11(4). https://doi.org/10.3390/genes11040357. Molecular approaches for diagnosis, therapy and prevention of cow´s milk allergy / B. Linhart, R. Freidl, O. Elisyutina [et al.] // Nutrients. - 2019. - Vol. 11, № 7. https://doi.org/10.3390/nu11071492. Linhart B, Freidl R, Elisyutina O, Khaitov M, Karaulov A, Valenta R. Molecular approaches for diagnosis, therapy and prevention of cow´s milk allergy. Nutrients. 2019;11(7). https://doi.org/10.3390/nu11071492. Cow’s milk allergy: From allergens to new forms of diagnosis, therapy and prevention / H. Hochwallner, U. Schulmeister, I. Swoboda [et al.] // Methods. - 2014. - Vol. 66, № 1. - Р. 22-33. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2013.08.005. Hochwallner H, Schulmeister U, Swoboda I, Spitzauer S, Valenta R. Cow’s milk allergy: From allergens to new forms of diagnosis, therapy and prevention. Methods. 201;66(1):22-33. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2013.08.005. Production of hypoallergenic milk from DNA-free beta-lactoglobulin (BLG) gene knockout cow using zinc-finger nucleases mRNA / Z. Sun, M. Wang, S. Han [et al.] // Scientific Reports. - 2018. - Vol. 8, № 1. https://doi.org/10.1038/s41598-018-32024-x. Sun Z, Wang M, Han S, Ma S, Zou Z, Ding F, et al. Production of hypoallergenic milk from DNA-free beta-lactoglobulin (BLG) gene knockout cow using zinc-finger nucleases mRNA. Scientific Reports. 2018;8(1). https://doi.org/10.1038/s41598-018-32024-x. Nongonierma, A. B. Enhancing bioactive peptide release and identification using targeted enzymatic hydrolysis of milk proteins / A. B. Nongonierma, R. J. FitzGerald // Analytical and Bioanalytical Chemistry. - 2018 - Vol. 410, № 15. - P. 3407-3423. https://doi.org/10.1007/s00216-017-0793-9. Nongonierma AB, FitzGerald RJ. Enhancing bioactive peptide release and identification using targeted enzymatic hydrolysis of milk proteins. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2018;410(15):3407-3423. https://doi.org/10.1007/s00216-017-0793-9. Nano-biosensing platforms for detection of cow’s milk allergens: An overview / M. Nehra, M. Lettieri, N. Dilbaghi [et al.] // Sensors. - 2019. - Vol. 20, № 1. https://doi.org/10.3390/s20010032. Nehra M, Lettieri M, Dilbaghi N, Kumar S, Marrazza G. Nano-biosensing platforms for detection of cow’s milk allergens: An overview. Sensors. 2019;20(1). https://doi.org/10.3390/s20010032. Rawlings, N. D. Origins of peptidases / N. D. Rawlings, A. Bateman // Biochimie. - 2019. - Vol. 166. - Р. 4-18. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.07.026. Rawlings ND, Bateman A. Origins of peptidases. Biochimie. 2019;166:4-18. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.07.026. Anti-inflammatory and antioxidant properties of casein hydrolysate produced using high hydrostatic pressure combined with proteolytic enzymes / F. Bamdad, S. H. Shin, J.-W. Suh [et al.] // Molecules. - 2017. -Vol. 22, № 4. https://doi.org/10.3390/molecules22040609. Bamdad F, Shin SH, Suh J-W, Nimalaratne C, Sunwoo H. Anti-inflammatory and antioxidant properties of casein hydrolysate produced using high hydrostatic pressure combined with proteolytic enzymes. Molecules. 2017;22(4). https://doi.org/10.3390/molecules22040609. Ферментативная обработка как инструмент придания функциональных свойств белкам молочной сыворотки / Е. Ю. Агаркова, А. Г. Кручинин, К. А. Рязанцева [и др.] // Аграрно-пищевые инновации. - 2019. - Т. 8, № 4. - С. 81-88. https://doi.org/10.31208/2618-7353-2019-8-81-88. Agarkova EYu, Kruchinin AG, Ryazantzeva KA, Pryanichnikova NS. Enzymatic processing as a tool of giving functional properties to proteins of milk serum. Agrarian-and-Food Innovations. 2019;8(4):81-88. (In Russ.). https://doi.org/10.31208/2618-7353-2019-8-81-88. Снижение аллергенных свойств белков молока. Технологические подходы / В. П. Курченко, Т. Н. Головач, В. И. Круглик [и др.] // Молочная промышленность. - 2012. - № 4. - С. 73-75. Kurchenko VP, Golovach TN, Kruglik VI, Haritonov VD, Agarkova EYu. Lowering of allergenic properties of milk proteins. Technological approaches. Dairy Industry. 2012;(4):73-75. (In Russ.). Пат. 2415943C1 Российская Федерация, МПК C12P21/06, C07K7/08. Биологически активный пептид, полученный из молочного белка / Козлова О. В., Разумникова И. С., Бабич О. О. [и др.]; заявитель и патентообладатель Козлова О. В., Разумникова И. С., Бабич О. О. [и др.]. - № 2010105589/10; заявл. 16.02.2010; опубл. 10.04.2011; Бюл. № 10. - 5 с. Kozlova OV, Razumnikova IS, Babich OO, Prosekov AYu, Kurbanova MG. Biologically active peptide prepared of lactic protein. Russia patent RU 2415943C1. 2011. Курбанова, М. Г. Исследование влияния фермент-субстратного соотношения на процесс гидролиза сывороточных белков / М. Г. Курбанова, К. А. Шевякова // Вестник современных исследований. - 2017. - Т. 11, № 8-1. - С. 38-40. Kurbanova MG, Shevyakova KA. Investigation of the influence of the enzyme-substract relation on the process of hydrolysis of serum proteins. Vestnik sovremennykh issledovaniy [Bulletin of Contemporary Research]. 2017;11(8-1):38-40. (In Russ.). Закономерности гидролиза сывороточных белков экзо- и эндопротеазами / Т. Н. Головач, Н. В. Гавриленко, Н. К. Жабанос [и др.] // Труды Белорусского государственного университета. Серия: Физиологические, биохимические и молекулярные основы функционирования биосистем. - 2008. - Т. 3, № 1. - С. 85-98. Golovach TN, Gavrilenko NV, Zhabanos NK, Kurchenko VP. Regularities of hydrolysis of whey proteins with exo- and endoproteases. Proceedings of the Belarusian State University. Series of Physiological, Biochemical and Molecular Biology Sciences. 2008;3(1):85-98. (In Russ.). ОФС.1.2.1.0023.15. Электрофорез в полиакриламидном геле [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-1-0023-15-elektroforez-v-poliakrilamidnom-gele/. - Дата обращения 03.11.2020. OFS.1.2.1.0023.15. Ehlektroforez v poliakrilamidnom gele [Polyacrylamide gel electrophoresis] [Internet]. [cited 2020 Nov 03]. Available from: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-1-0023-15-elektroforez-v-poliakrilamidnom-gele/. Comparison of the allergenicity and immunogenicity of camel and cow’s milk - A study in brown Norway rats / N. Z. Maryniak, E. B. Hansen, A.-S. R. Ballegaard [et al.] // Nutrients. - 2018. - Vol. 10, № 12. https://doi.org/10.3390/nu10121903. Maryniak NZ, Hansen EB, Ballegaard A-SR, Sancho AI, Bøgh KL. Comparison of the allergenicity and immunogenicity of camel and cow’s milk - A study in brown Norway rats. Nutrients. 2018;10(12). https://doi.org/10.3390/nu10121903. Курбанова, М. Г. Направленный гидролиз белков молока / М. Г. Курбанова, О. О. Бабич, А. Ю. Просеков // Молочная промышленность. - 2010. - № 10. - С. 73-75. Kurbanova MG, Babich OO, Prosekov AYu. Directed hydrolysis of milk proteins. Dairy Industry. 2010;(10):73-75. (In Russ.). Modulation of milk allergenicity by baking milk in foods: A proteomic investigation / S. L. Bavaro, E. De Angelis, S. Barni [et al.] // Nutrients. - 2019. - Vol. 11, № 7. https://doi.org/10.3390/nu11071536. Bavaro SL, De Angelis E, Barni S, Pilolli R, Mori F, Novembre EM, et al. Modulation of milk allergenicity by baking milk in foods: A proteomic investigation. Nutrients. 2019;11(7). https://doi.org/10.3390/nu11071536. Azdad, O. Reduction of the allergenicity of cow’s milk α-lactalbumin under heat-treatment and enzymatic hydrolysis in Moroccan population / O. Azdad, N. Mejrhit, L. Aarab // European Annals of Allergy and Clinical Immunology. - 2018. - Vol. 50, № 4. - Р. 177-183. https://doi.org/10.23822/EurAnnACI.1764-1489.60. Azdad O, Mejrhit N, Aarab L. Reduction of the allergenicity of cow’s milk α-lactalbumin under heat-treatment and enzymatic hydrolysis in Moroccan population. European Annals of Allergy and Clinical Immunology. 2018;50(4):177-183. https://doi.org/10.23822/EurAnnACI.1764-1489.60. Агаркова, Е. Ю. Ферментативная конверсия как способ получения биологически активных пептидов / Е. Ю. Агаркова, А. Г. Курчинин // Вестник мурманского государственного технического университета. - 2018. - Т. 21, № 3. - С. 412-419. https://doi.org/10.21443/1560-9278-2018-21-3-412-419. Agarkova EYu, Kruchinin AG. Enzymatic conversion as a method of producing biologically active peptides. Vestnik of MSTU. 2018;21(3):412-419. (In Russ.). https://doi.org/10.21443/1560-9278-2018-21-3-412-419. Кручинин, А. Г. Использование протеолиза белков молока при разработке молочных продуктов со сниженной аллергенностью / А. Г. Кручинин, К. А. Рязанцева, Е. Ю. Агаркова // Международная научно-практическая конференция, посвященная памяти Василия Матвеевича Горбатова. - 2015. - № 1. - С. 289-291. Kruchinin AG, Ryazantseva KA, Agarkova EYu. Use of milk protein proteolysis in development of dairy products with reduced allergenicity. International scientific-practical conference dedicated to the memory of Vasily Matveevich Gorbatov. 2015;(1):289-291. (In Russ.). Яйленко, А. А. Роль макро- и микронутриентов в профилактике и коррекции когнитивных расстройств у детей / А. А. Яйленко // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. - 2020. - Т. 19, № 1. - С. 216-226. Yaylenko AA. Role of macro- and micronutrients in the prevention and correction of cognitive disorders in children. Vestnik of the Smolensk State Medical Academy. 2020;19(1):216-226. (In Russ.). Protein digestion of baby foods: Study approaches and implications for infant health / J. Gan, G. M. Bornhorst, B. M. Henrick [et al.] // Molecular Nutrition and Food Research. - 2018. - Vol. 62, № 1. https://doi.org/10.1002/mnfr.201700231. Gan J, Bornhorst GM, Henrick BM, German JB. Protein digestion of baby foods: Study approaches and implications for infant health. Molecular Nutrition and Food Research. 2018;62(1). https://doi.org/10.1002/mnfr.201700231. Identification and quantification of phenolic compounds of Western Siberia Astragalus danicus in different regions / O. Babich, A. Prosekov, A. Zaushintsena [et al.] // Heliyon. - 2019. - Vol. 5, № 8. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2019.e02245. Babich O, Prosekov A, Zaushintsena A, Sukhikh A, Dyshlyuk L, Ivanova S. Identification and quantification of phenolic compounds of Western Siberia Astragalus danicus in different regions. Heliyon. 2019;5(8). https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2019.e02245.