<!DOCTYPE article
PUBLIC "-//NLM//DTD JATS (Z39.96) Journal Publishing DTD v1.4 20190208//EN"
       "JATS-journalpublishing1.dtd">
<article xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" xmlns:xlink="http://www.w3.org/1999/xlink" xmlns:xsi="http://www.w3.org/2001/XMLSchema-instance" article-type="research-article" dtd-version="1.4" xml:lang="en">
 <front>
  <journal-meta>
   <journal-id journal-id-type="publisher-id">Food Processing: Techniques and Technology</journal-id>
   <journal-title-group>
    <journal-title xml:lang="en">Food Processing: Techniques and Technology</journal-title>
    <trans-title-group xml:lang="ru">
     <trans-title>Техника и технология пищевых производств</trans-title>
    </trans-title-group>
   </journal-title-group>
   <issn publication-format="print">2074-9414</issn>
   <issn publication-format="online">2313-1748</issn>
  </journal-meta>
  <article-meta>
   <article-id pub-id-type="publisher-id">39769</article-id>
   <article-id pub-id-type="doi">10.21603/2074-9414-2020-3-450-459</article-id>
   <article-categories>
    <subj-group subj-group-type="toc-heading" xml:lang="ru">
     <subject>НАУЧНАЯ СТАТЬЯ</subject>
    </subj-group>
    <subj-group subj-group-type="toc-heading" xml:lang="en">
     <subject>RESEARCH ARTICLE</subject>
    </subj-group>
    <subj-group>
     <subject>НАУЧНАЯ СТАТЬЯ</subject>
    </subj-group>
   </article-categories>
   <title-group>
    <article-title xml:lang="en">The Effect of Trehalose on Dispersion of Ice Crystals and Consistency of Low-Fat Ice Cream</article-title>
    <trans-title-group xml:lang="ru">
     <trans-title>Влияние трегалозы на дисперсность кристаллов льда и консистенцию низкожирного мороженого</trans-title>
    </trans-title-group>
   </title-group>
   <contrib-group content-type="authors">
    <contrib contrib-type="author">
     <contrib-id contrib-id-type="orcid">https://orcid.org/0000-0001-5881-2309</contrib-id>
     <name-alternatives>
      <name xml:lang="ru">
       <surname>Ландиховская</surname>
       <given-names>Анна Валентиновна</given-names>
      </name>
      <name xml:lang="en">
       <surname>Landikhovskaya</surname>
       <given-names>Anna V.</given-names>
      </name>
     </name-alternatives>
     <email>anna.landih@yandex.ru</email>
     <bio xml:lang="ru">
      <p>кандидат технических наук;</p>
     </bio>
     <bio xml:lang="en">
      <p>candidate of technical sciences;</p>
     </bio>
     <xref ref-type="aff" rid="aff-1"/>
    </contrib>
    <contrib contrib-type="author">
     <contrib-id contrib-id-type="orcid">https://orcid.org/0000-0001-7293-9162</contrib-id>
     <name-alternatives>
      <name xml:lang="ru">
       <surname>Творогова</surname>
       <given-names>Антонина Анатольевна</given-names>
      </name>
      <name xml:lang="en">
       <surname>Tvorogova</surname>
       <given-names>Antonina A.</given-names>
      </name>
     </name-alternatives>
     <bio xml:lang="ru">
      <p>доктор технических наук;</p>
     </bio>
     <bio xml:lang="en">
      <p>doctor of technical sciences;</p>
     </bio>
     <xref ref-type="aff" rid="aff-2"/>
    </contrib>
    <contrib contrib-type="author">
     <contrib-id contrib-id-type="orcid">https://orcid.org/0000-0002-2963-6294</contrib-id>
     <name-alternatives>
      <name xml:lang="ru">
       <surname>Казакова</surname>
       <given-names>Наталия Владимировна</given-names>
      </name>
      <name xml:lang="en">
       <surname>Kazakova</surname>
       <given-names>Natalia V.</given-names>
      </name>
     </name-alternatives>
     <email>kazakova-n-v@mail.ru</email>
     <xref ref-type="aff" rid="aff-3"/>
    </contrib>
    <contrib contrib-type="author">
     <contrib-id contrib-id-type="orcid">https://orcid.org/0000-0002-8177-3472</contrib-id>
     <name-alternatives>
      <name xml:lang="ru">
       <surname>Гурский</surname>
       <given-names>Игорь Алексеевич</given-names>
      </name>
      <name xml:lang="en">
       <surname>Gursky</surname>
       <given-names>I. A.</given-names>
      </name>
     </name-alternatives>
     <email>lixrug@yandex.ru</email>
     <xref ref-type="aff" rid="aff-4"/>
    </contrib>
   </contrib-group>
   <aff-alternatives id="aff-1">
    <aff>
     <institution xml:lang="ru">Всероссийский научно-исследовательский институт холодильной промышленности – филиал Федерального научного центра пищевых систем им. В. М. Горбатова РАН</institution>
     <city>Москва</city>
     <country>Россия</country>
    </aff>
    <aff>
     <institution xml:lang="en">All-Russian Scientific Research Institute of Refrigeration Industry - branch of V.M. Gorbatov Federal Research Center for Food Systems of Russian Academy of Science</institution>
     <city>Moscow</city>
     <country>Russian Federation</country>
    </aff>
   </aff-alternatives>
   <aff-alternatives id="aff-2">
    <aff>
     <institution xml:lang="ru">Всероссийский научно-исследовательский институт холодильной промышленности</institution>
     <city>Москва</city>
     <country>Россия</country>
    </aff>
    <aff>
     <institution xml:lang="en">All-Russian Scientific Research Institute of Refrigeration Industry</institution>
     <city>Moscow</city>
     <country>Russian Federation</country>
    </aff>
   </aff-alternatives>
   <aff-alternatives id="aff-3">
    <aff>
     <institution xml:lang="ru">Всероссийский научно-исследовательский институт холодильной промышленности - филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН</institution>
     <country>Россия</country>
    </aff>
    <aff>
     <institution xml:lang="en">All-Russian Scientific Research Institute of Refrigeration Industry - branch of V.M. Gorbatov Federal Research Center for Food Systems of Russian Academy of Science</institution>
     <country>Russian Federation</country>
    </aff>
   </aff-alternatives>
   <aff-alternatives id="aff-4">
    <aff>
     <institution xml:lang="ru">ВНИХИ — филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В. М. Горбатова» РАН</institution>
     <city>Москва</city>
     <country>Россия</country>
    </aff>
    <aff>
     <institution xml:lang="en">VNIHI – Branch of Gorbatov Research Center for Food Systems</institution>
     <city>Moscow</city>
     <country>Russian Federation</country>
    </aff>
   </aff-alternatives>
   <volume>50</volume>
   <issue>3</issue>
   <fpage>450</fpage>
   <lpage>459</lpage>
   <self-uri xlink:href="http://fptt.ru/eng/?page=archive&amp;jrn=58&amp;article=7">http://fptt.ru/eng/?page=archive&amp;jrn=58&amp;article=7</self-uri>
   <abstract xml:lang="ru">
    <p>Введение. Целью проводимого исследования являлось установление влияния полной и частичной замены сахарозы трегалозой на дисперсность кристаллов льда в мороженом с низкой массовой долей жира и сухих веществ.&#13;
Объекты и методы исследования. Мороженое с массовой долей жира 3 % с полной заменой сахарозы (15,5 %) и частичной (7,5 % и 3 %) и контрольный образец с массовой долей сахарозы 15,5 %. Использованы современные методы исследований для контроля консистенции по показателю «динамическая вязкость» – ротационной вискозиметрии и микроструктурные для определения дисперсности кристаллов льда и воздушной фазы.&#13;
Результаты и их обсуждение. Экспериментально подтверждено, что использование трегалозы в количестве 3,0 %,  7,5 % и 15,5 % с целью замены сахарозы приводит к заметному повышению дисперсности кристаллов льда и ее сохранению в процессе хранения продукта. При этом значительная часть кристаллов льда через 3 месяца хранения в образцах мороженого с трегалозой характеризуется размером не более 45 мкм при пороге органолептической ощутимости не более 50 мкм, в контрольном образце (15,5 % сахарозы) – не более 60 мкм. Экспериментально определено влияние трегалозы на консистенцию мороженого по показателям: динамическая вязкость, взбитость и дисперсность воздушной фазы. Результаты исследований показали, что при внесении 15,5 % трегалозы динамическая вязкость смеси для мороженого увеличивается в 1,2 раза по сравнению с образцом, содержащим сахарозу в той же концентрации. Показано, что применение трегалозы способствует сохранению дисперсности воздушной фазы при хранении, определяемой по показателю «средний диаметр воздушных пузырьков». Через 3 месяца максимальная дисперсность отмечена в образце № 1 с 15,5 % трегалозы, что на 17 % выше, чем в контрольном образце с массовой долей сахарозы 15,5 %.&#13;
Выводы. Проведенные исследования показывают целесообразность замены сахарозы на трегалозу в производстве мороженого функциональной направленности (с низким содержанием жира и сахарозы).</p>
   </abstract>
   <trans-abstract xml:lang="en">
    <p>Introduction. The research objective was to establish the effect of the complete and partial replacement of sucrose by trehalose on the dispersion of ice crystals in ice cream with a low mass fraction of fat and solids. &#13;
Study objects and methods. The present research featured three test samples of ice cream with a 3% mass fraction of fat: one with a complete replacement of sucrose (15.5%) and two with a partial replacement of 7.5% and 3%. In the control sample, the mass fraction of sucrose was 15.5%. To control the dynamic viscosity indicator of consistency, the research employed such an advanced method as rotational viscometry. Microstructure methods were used to determine the dispersion of ice crystals and the air phase.&#13;
Results and discussion. The usage of trehalose in the production of low-fat ice cream in the amounts of 3.0%, 7.5%, and 15% increased the dispersion of ice crystals and preserved it during storage. After three months of storage, most ice crystals in the test ice cream samples had a size of ≤ 45 μm with an organoleptic sensibility of ≤ 50 μm, while in the control sample (15.5% of sucrose) it did not exceed 60 μm. The experiment determined the effect of trehalose on the consistency of ice cream according to the following indicators: dynamic viscosity, overrun, and dispersion of the air phase. 15.5% of trehalose increased the dynamic viscosity of ice cream mix by 1.2 times as compared to the sample with the same concentration of sucrose. According to the average diameter of air bubbles, trehalose helped to preserve the dispersion of the air phase during storage. After three months, Sample 1 with 15.5%  of trehalose demonstrated the maximum dispersion, which was 17% higher than in the control sample with a sucrose mass fraction  of 15.5%.&#13;
Conclusion. The complete (15.5%) and partial (3% and 7.5%) sucrose replacement by trehalose in low-fat ice cream increased the dispersion of ice crystals and improved its consistency. Unlike the sample with 15.5% of sucrose, samples with trehalose had smaller ice crystals, which remained the same after three months. The trehalose samples had a better dynamic viscosity and air saturation. The research requires a further study of dispersion of ice crystals after 12 months of storage.</p>
   </trans-abstract>
   <kwd-group xml:lang="ru">
    <kwd>Готовые продукты питания</kwd>
    <kwd>сахароза</kwd>
    <kwd>трегалоза</kwd>
    <kwd>динамическая вязкость</kwd>
    <kwd>дисперсность</kwd>
    <kwd>кристаллы льда</kwd>
    <kwd>пузырьки</kwd>
   </kwd-group>
   <kwd-group xml:lang="en">
    <kwd>Finished food products</kwd>
    <kwd>sucrose</kwd>
    <kwd>trehalose</kwd>
    <kwd>dynamic viscosity</kwd>
    <kwd>dispersion</kwd>
    <kwd>ice crystals</kwd>
    <kwd>air bubbles</kwd>
   </kwd-group>
  </article-meta>
 </front>
 <body>
  <p>ВведениеПолитика в области здорового питаниянаправлена на производство продуктов с заданным(полезным для здоровья) химическим составомс целью восполнения недостающих макро- имикронутриентов [1]. Современные тенденции вобласти развития рынка продуктов для здоровогопитания характеризуются увеличением спроса наданный вид продукции, происходит расширение ужеимеющегося ассортимента. Производители стараютсявыносить информацию об отличительных признакахпродукции на этикетку [2].Рынок мороженого в настоящее время взначительной степени представлен мороженымпломбир, имеющим высокое содержание жира (неменее 12 %) и сахарозы (не менее 14 %).Снижение массовой доли жира в мороженом– один из способов уменьшения калорийностипродукта. Тем не менее изменение массовой долижира влияет на качество конечного продукта:восприятие сладости и ощущение кристаллов льдав продукте [3]. В настоящее время для повышенияощущения жирности в низкожирном мороженом вкачестве дополнительных компонентов используютмальтодекстрины, инулин и полидекстрозу [4].Сахара оказывают влияние на состояниеструктуры мороженого и его вкусовые достоинства.Их способность снижать температуру замерзанияраствора и влиять на долю вымороженной водыобеспечивает контроль над соотношением темпе-ратуры и твердости. Наиболее распространен-ным подсластителем является сахароза, но впоследнее время существуют тенденции к ее заменена другие сахарозаменители. При этом важноучитывать влияние углеводов на качество конечногопродукта [5]. Одним из таких углеводов являетсятрегалоза.Подсластители влияют не только на вкусмороженого, но также оказывают влияние надругие характеристики: снижение криоскопическойтемпературы, рост кристаллов льда, осмотическаясила раствора, способность вступать в реакции(например, с первичными аминами) и надинамическую вязкость растворов [6]. В качествезаменителя сахарозы или совместного использованияинтерес представляет трегалоза, имеющаяодинаковую с ней молекулярную массу. Трегалозаи сахароза являются дисахаридами с одинаковойхимической формулой C12H22O11, но с различнымгеометрическим строением [7].Трегалоза – это углевод, дисахарид, состоящийиз двух остатков α-D-глюкозопиранозила и α-D-глюкозопиранозида, связанных между собойгликозидными связями. Была впервые описана внаучных работах в начале XIX века. Считалось,что она присутствует в спорынье ржи. Однакопозже выяснилось, что она распространена вразных организмах. В основном трегалоза изученав клетках дрожжей. Трегалоза является одним изсамых неактивных и стабильных сахаров в природе.Две глюкозные группы соединены через 1,1 атомауглерода двух глюкозопиранозных колец, поэтомуэто полностью невосстанавливающийся сахар.Кислородная связь гликозида, соединенных в двагексозных кольца, имеет низкую энергетическуюсвязь (&lt; 1 ккал/моль), которая делает дисахариднуюструктуру стабильной. Для сравнения, другойневосстанавливающийся дисахарид, сахароза,характеризуется высокоэнергетической связью (более27 ккал/моль). При этом, несмотря на стабильностьсахарозы как чистого вещества, в присутствиихимически реактивных аминогрупп белков она легкорасщепляется до глюкозы и фруктозы, которыеявляются восстанавливающими моносахарами [8].Природная активность трегалозы, а такжеодобрение пищевой и фармацевтическойпромышленности позволяют использовать ее сцелью контроля подвижности воды [9]. Трегалозаотличается от других дисахаридов большимколичеством экваториальных гидроксильных групп.Это приводит к сильным взаимодействиям с водойв растворе и относительной легкости, с которойона может включить себя в кластер воды. Сахароза,напротив, плохо интегрируется в кластер воды,создавая более крупную структуру по сравнению стрегалозой.Несмотря на то, что молекулы сахарозыи трегалозы имеют сходную молекулярнуюструктуру, есть несколько важных различий в ихсвойствах взаимодействия с водой: растворимость,вязкость и температура стеклования [10]. Сахарозаимеет высокую растворимость в воде: в 1 г водырастворяется 2,14 г сахарозы. В таком же количествеводы можно растворить только 1,1 г трегалозы [11].В работе C. Olsson и J. Swenson была изученаструктура водных растворов дисахаридов с помощьюнейтронной и рентгеновской дифракции в сочетаниис эмпирическим моделированием уточненияструктуры потенциала [7]. Результаты показали, чтоотличий между этими дисахаридами немного, нотрегалоза больше нарушает структуру воды.Сахароза и трегалоза используются в качествестабилизирующих агентов для различных целейхранения. Но трегалозу лучше использовать дляхранения в биологических целях [12].В работе A. P. Whelan с соавторами исследовалосьвлияние трегалозы на стеклование и рост кристалловльда в смесях для мороженого с массовой долей жира10 % [13]. Содержание сахарозы и трегалозы было0, 3, 6, 9, 12 и 15 % соответственно. В сумме обадисахарида всегда давали 15 % с шагом 3 %. Авторыотмечают, что температура стеклования (Tg) в смесяхмороженого возрастала с увеличением концентрациитрегалозы. Tg (в средней точке) увеличилась на4,5 °С: в смеси мороженого с содержанием сахарозы15 % она составляла –46,4 ± 1,0 °С, а в смеси стаким же количеством трегалозы температурастеклования была –42 ± 0,2 °С. В остальныхсмесях Tg варьировалась от –45,4 °С до –43,5 °С соснижением сахарозы и возрастанием количестватрегалозы. Авторы отмечают, что трегалоза непоказала существенных различий в ингибированиискорости роста кристаллов льда в мороженомпри ее внесении в количестве 15 % в сравнении ссахарозой, используемой на том же уровне. Скоростьроста кристаллов льда после циклов колебаниятемпературы в этих образцах мороженого былана уровне 160 %. При этом авторы акцентироваливнимание на том, что если образец с количествомтрегалозы 15 % убрать из цепочки сравнения, тос увеличением массовой доли трегалозы (3–12 %)наблюдается тенденция к снижению скорости ростовкристаллов льда (P = 0,094). Она изменяется от 153до 141 %.Популярность трегалозы растет в связи с тем,что она имеет низкую сладость, по сравнениюс сахарозой, но при этом оставляет длительноепослевкусие сладости, может подавлять горечь иулучшать вкус пищи [14].Трегалозу исследуют во многих отрасляхпищевой промышленности: в мясной отрасли, припроизводстве лиофилизированной пшеничнойзакваски и для хранения замороженных креветок[15–17].Мороженое с низким содержанием жира 3 %характеризуется массовой долей сухих веществ29,5 %, остальное приходится на долю воды.Известно, что кристаллы льда более склонны кросту и рекристаллизации, когда в продукте высокоесодержание водной фазы [18]. Для предотвращениябыстрого роста кристаллов льда существуетнеобходимость в применении компонентов, позво-ляющих ингибировать их рост и обладающихводосвязывающей способностью.Анализ литературных данных показал, чтотрегалоза является хорошей альтернативой дляполной или частичной замены сахарозы. Областьприменения трегалозы при производстве мороженогос низким содержанием жира не до конца изучена.Интерес представляет изменение дисперсностикристаллов льда в мороженом с использованиемтрегалозы в процессе хранения, а также ее влияние наконсистенцию мороженого.Целью исследований является определениевлияния на дисперсность кристаллов льда иконсистенцию в низкожирном мороженом полной ичастичной замены сахарозы трегалозой.Объекты и методы исследованияИзучаемые образцы мороженого быливыработаны на экспериментальном стенде ВНИХИ влаборатории технологии мороженого в соответствиис традиционной схемой его производства.При изготовлении образцов использовалиследующее сырье: молоко сухое обезжиренное поГОСТ 33629-2015, масло сливочное с массовойдолей жира 72,5 % по ГОСТ 32261-2013, сахар белыйпо ГОСТ 33222-2015, эффективный комплексныйстабилизатор-эмульгатор, подсластитель стевиозид(E960). Трегалоза (Китай) предоставлена компаниейООО «Торгснаб».Для определения динамической вязкости смесимороженого пользовались методом ротационнойвискозиметрии с использованием вискозиметраBrookfield DV-II+Pro (США), подключенного ккомпьютеру, с предварительно установленной453Ландиховская А. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 3 С. 450–459программой обработки данных Rheocalc V3.1-1(США). Для достижения необходимой температурыизмерения (4,0 ± 0,5 °C) применялась водяная баня.Взбитость мороженого определяли в соответствиис методикой, описанной в ГОСТ 31457-2012.Исследование состояния кристаллов льда вмороженом проводилось с помощью микроскопаOlympus CX41RF (Япония) со встроенной камеройи программируемым управлением. Полученныефотографии обрабатывались с использованиемпрограммного обеспечения ImageScope (Рос-сия) [19]. Все измерения были выполнены в 3-хкратной повторности.На основании полученных экспериментальныхданных были построены кривые распределения,характеризующие дисперсность кристаллов льда впроцессе хранения.С помощью Microsoft Office Excel рассчитывалиськоличественные доли линейных размеров кристалловльда с шагом 5 мкм (0 &gt; Χ ≥ 5, 5 &lt; X ≤ 10, 10 &lt; X≤ 15 и т. д.). Затем выстраивалась «точечнаядиаграмма с маркерами», где на оси абсциссоткладывались линейные размеры кристалловльда, а на оси ординат – количественная доля этихкристаллов, принадлежащая данному интервалу.По полученным точкам на графике строиласьлиния тренда для выявления тенденций измененияколичества кристаллов льда в зависимости от ихразмеров. В случае анализа дисперсности кристалловльда используется полиноминальная линия тренда,поскольку она характеризует перемены возрастанияи убывания количества кристаллов льда различныхразмеров.Дисперность воздушной фазы определялась припомощи микроскопа Olympus CX41RF (Япония) совстроенной фотокамерой и программой ImageScope(Россия). Отбор проб осуществлялся у образцовс температурой не выше –18 °С. Исследованиепроводилось при температуре окружающей среды.Диаметр воздушных пузырьков определялся врежиме «ручное измерение». Полученные данныеобсчитывались в Excel с помощью встроеннойфункции «СРГЕОМ».Образцы мороженого хранились при отрица-тельной температуре –20 ± 2 °С без существенныхтемпературных колебаний.Результаты и их обсуждениеОбоснование композиционного состава. На первойстадии исследования обоснован композиционныйсостав мороженого:– установлена минимально допустимая массовая долясухих веществ для молочного мороженого с цельюполучения достоверных данных о влиянии трегалозына структуру продукта (дисперсность кристалловльда);– выбор массовой доли жира определен исходя изнеобходимости производства продукции с низкимсодержанием жира в соответствии с направлениемгосударственной политики в области питания ивозможности вынесения данной информации наэтикетку;– массовая доля СОМО выбрана с целью сохранениямолочного вкуса, а также для обеспечения сухихвеществ молока в мороженом на уровне 40 % как длямолочно-составного продукта;– содержание трегалозы в количестве 15,5 %выбрано из возможности производства мороженогобез сахарозы, а 7,5 % и 3 % – с целью установлениявлияния массовой доли трегалозы на дисперсностькристаллов льда;– массовая доля стабилизатора-эмульгаторав количестве 0,62 % максимальна для даннойразновидности мороженого. Кроме того, в составкомплексной стабилизационной системы входитэффективный эмульгатор, оказывающий влияниена дисперсность воздушной фазы. В качествестабилизаторов использовали набор гидроколлоидов,действие которых направлено на улучшениетермоустойчивости продукта, поскольку снижениеразмеров кристаллов льда сказывается на данномпоказателе.Химический состав опытных образцов морожено-го представлен в таблице 1.Образцы мороженого отличаются между собойколичеством вносимой трегалозы. В качествеконтрольного образца использовали образец ссодержанием сахарозы 15,5 %. Поскольку сладостьтрегалозы составляет 45 % от сладости сахарозы,то в образцах (№ 1–3) использовался подсластительстевиозид из расчета, что его сладость выше в300 раз. Конечная сладость опытных образцовсоответствовала контролю.Таблица 1. Химический состав мороженогоTable 1. Chemical composition of ice creamОбразец № 1 Образец № 2 Образец № 3 КонтрольМассовая доля сухих веществ, в %, не менее, в т. ч.: 29,5 29,5 29,5 29,5Молочного жира, %, не менее 3,0 3,0 3,0 3,0СОМО, %, не менее 10,5 10,5 10,5 10,5Сахарозы, %, не менее – 8,0 12,5 15,5Трегалозы, %, не менее 15,5 7,5 3,0 –Стабилизатора-эмульгатора, %, не менее 0,62 0,62 0,62 0,62454Landikhovskaya A.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 3, pp. 450–459500 мкм 500 мкм500 мкм 500 мкм500 мкм 500 мкм500 мкм 500 мкмРисунок 2. Микрофотографии кристаллов льдачерез 3 месяца храненияFigure 2. Micrographs of ice crystals after 3 months of storageОбразец № 1 Образец № 2Рисунок 1. Микрофотографии кристаллов льда послезакаливанияFigure 1. Micrographs of ice crystals after hardeningОбразец № 3 КонтрольОбразец № 1 Образец № 2Образец № 3 КонтрольДобавление трегалозы на стадии приготовлениясмеси не требует дополнительной подготовки.Рекомендовано вносить на стадии смешивания сухихкомпонентов.Исследование дисперсности кристаллов льда.Дисперсность кристаллов льда в образцах иссле-довали после закаливания и в течение 3 месяцевхранения (контрольные точки – 1 мес и 3 мес) притемпературе –20 ± 2 °С.После закаливания мороженого была проведенаорганолептическая оценка образцов. Отмечено, чтоконтроль обладает сладким вкусом по сравнению сопытными образцами. Все образцы, в состав которыхвходит трегалоза, имеют мелкокристаллическуюструктуру. Это подтверждается микрофотографиямикристаллов льда в мороженом (рис. 1, 2).При визуальной оценке фотографий через3 месяца хранения очевидно, что в мороженом ссахарозой кристаллы значительно крупнее, чем вобразцах с трегалозой.На рисунках 3–5 представлены кривыераспределения кристаллов льда по размерам послезакаливания через 1 и 3 месяца хранения.Данные рисунков 3 и 4 свидетельствуюто том, что в течение 1 месяца хранения непроисходит изменений в размерах кристалловльда. Средние размеры кристаллов льда в образце№ 1 увеличиваются с 19 до 20 мкм, в образце № 3с 20 до 21 мкм, а в образцах № 2 и № 4 сохраняютстабильность на уровне 18 и 23 мкм соответственно.Как следует из данных, приведенных на рисунке5, использование трегалозы в рецептурах мороженогоприводит к увеличению дисперсности кристалловльда. Пик дифференциальной кривой распределениякристаллов льда по размерам через 3 месяца хранениясо значения 35 мкм в контрольном образце смещаетсявлево на значения 15 и 18 мкм в образцах с трегалозой.В образцах с трегалозой значительная частькристаллов льда характеризуется размером – не более45 мкм при пороге органолептической ощутимостине более 50 мкм, в контрольном образце не болееРисунок 3. Кривые распределения кристаллов льда послезакаливания мороженогоFigure 3. Distribution curves of ice crystals after ice cream hardeningРисунок 4. Кривые распределения кристаллов льда через1 месяц хранения мороженогоFigure 4. Curves of ice crystal distribution after 1 monthof ice cream storage455Ландиховская А. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 3 С. 450–45960 мкм. Следует отметить, что при массовой долетрегалозы 3, 7,5 и 15,5 % дисперсность кристалловльда не отличается. Отмечается незначительновыраженная тенденция снижения дисперсностикристаллов льда при увеличении массовой долитрегалозы в мороженом. Это также подтверждаетсяизмерениями средних размеров кристалловльда: контроль – 37 мкм, образец № 1 – 24 мкм,образец № 2 – 23 мкм, образец № 3 – 22 мкм.В таблице 2 представлена количественнаядоля (%) кристаллов льда размером до 50 мкм вобразцах в процессе хранения.Исследование влияния трегалозы наконсистенцию продукта. Учитывая положительноевлияние трегалозы на дисперсность кристалловльда, исследовали ее влияние на взаимосвязанныйпоказатель – консистенцию.К показателям, оказывающим влияние наконсистенцию мороженого, относятся эффективнаядинамическая вязкость смеси, взбитость мороженогопри выгрузке его из фризера и дисперсностьвоздушной фазы.На рисунке 6 представлены показатели дина-мической вязкости смеси после приготовления иохлаждения до температуры созревания 4 ± 2 °С приградиенте сдвига на срез 0,83 с–1.Полученные данные свидетельствуют отенденции увеличения динамической вязкости прииспользовании трегалозы для полной и частичнойзамены сахарозы. По мере увеличения количествавносимой трегалозы и уменьшения массовойдоли сахарозы вязкость смеси для мороженогоувеличивается. В образце № 3 (3 % трегалозы)значение показателя вязкости на уровне этогопоказателя в контрольном образце (15,5 % сахарозы).В образцах № 2 (7,5 % трегалозы) и № 1 (15,5 %трегалозы) вязкость увеличивается в 1,1 и 1,2 разасоответственно по сравнению с контрольнымобразцом.Поскольку молекулярная масса трегалозы исахарозы находится на одном уровне, то заменаодного компонента другим не вносит измененийв технологические режимы работы оборудованияпри фризеровании. Мороженое выгружалось притемпературе от –5,2 до –5,5 °С. Взбитость мороженогопосле фризерования в образце № 1 составила 118 %,в № 2 – 92,5 %, в № 3 – 68 % и в контроле – 94 %.При изготовлении мороженого использовался фризерпериодического действия без принудительнойподачи воздуха под давлением, как и во фризерахнепрерывного действия. Следует отметить, что вРисунок 5. Кривые распределения кристаллов льдачерез 3 месяца хранения мороженогоFigure 5. Distribution curves of ice crystals after 3 monthsof ice cream storageТаблица 2. Количественная доля кристаллов льда размером не более 50 мкмTable 2. Quantitative fraction of ice crystals of ≤ 50 microns in sizeЭтап исследования Образец № 1 Образец № 2 Образец № 3 Контрольпосле закаливания 99,0 99,0 98,0 96,0через 3 месяца хранения 97,0 97,0 96,0 78,0Рисунок 6. Динамическая вязкость смесив образцах после охлажденияFigure 6. Dynamic viscosity of the mix in the samples after coolingОбразец № 1 Образец № 2Образец № 3 КонтрольРисунок 7. Микрофотографии состояния воздушной фазыв мороженом после закаливанияFigure 7. Micrographs of the air phase in ice cream after hardening456Landikhovskaya A.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 3, pp. 450–459образцах только с одним дисахаридом взбитостьвыше, чем при их совместном использовании. Вобразце, где соотношение трегалозы и сахарозы1:1, взбитость выше в 1,4 раза, чем в образце ссодержанием трегалозы 3 % и сахарозы 12,5 %. Привыгрузке из фризера мороженое только с трегалозойболее плотное и менее пластичное при фасовании.Способность к насыщению воздухом упала вобразце № 3. Можно предположить, что композициятрегалозы (3 %) и сахарозы (12,5 %) оказываетотрицательное воздействие на способность снижатьповерхностное натяжение на границе раздела фаз«воздух-плазма». Это привело к потере системнойспособности к насыщению воздухом.Помимо динамической вязкости и взбитости,на консистенцию мороженого оказывает влияниедисперсность воздушной фазы. Насыщение воздухомпроисходит на стадии фризерования продукта, каки первичное зарождение кристаллов льда. Поэтомуможно говорить о взаимосвязи этих процессов.На рисунке 7 приведены микрофотографиивоздушных пузырьков после закаливания образцов.Как видно на фотографиях, наиболее крупныепузырьки в образце № 3. Это также подтверждаетсяизмерением среднего диаметра воздушныхпузырьков. В образцах № 1 и № 2 он составил 15 мкм,в образце № 3 – 21 мкм, в контроле – 16 мкм.Стоит отметить, что через 3 месяца хранения среднийдиаметр в образцах № 1 и № 2 увеличился в 1,4 и1,7 раза соответственно, в образце № 3 – 1,3 раза,в контроле – в 1,9 раза. Таким образом, подисперсности воздушной фазы наиболее стабиленобразец № 3. Это обусловлено его наименьшейвзбитостью.В таблице 3 представлена количественная доля (%)воздушных пузырьков размером до 50 мкм в течение3 месяцев храненияСледует отметить, что через 3 месяца хранениямаксимальная дисперсность воздушной фазыотмечена в образце № 1 с 15,5 % трегалозы, анаименьшая дисперсность у контрольного образца.Различия между ними составили 17 %. В образцахс частичной заменой сахарозы на трегалозудисперсность воздушной фазы не отличается.Расхождения между ними на уровне 2 %.Стоит отметить, что мелкие кристаллы льда впроцессе хранения оказывают меньшее воздействиена дисперсность воздушной фазы.Таким образом, внесение в мороженое трегалозыв количестве 15,5 %, 7 % и 3 % положительносказывается на дисперсности воздушной фазы.ВыводыВ результате исследования влияния полной ичастичной замены сахарозы трегалозой с цельюповышения дисперсности кристаллов льда вмороженом с низкой массовой долей жира и сухихвеществ установлено:– использование трегалозы в количестве не менее,чем 3 % для замены сахарозы приводит к заметномуповышению дисперсности кристаллов льда иее сохранению в процессе хранения продукта.Значительная часть кристаллов льда характеризуетсяразмером – не более 45 мкм при порогеорганолептической ощутимости не более 50 мкм;– замена сахарозы на трегалозу оказывает положи-тельное влияние на консистенцию мороженого: посравнению с показателями контрольного образцав образце с массовой долей трегалозы 15,5 %динамическая вязкость выше в 1,2 раза, содержаниевоздушных пузырьков размером менее 50 мкмувеличилось почти на 20 %.Проведенные исследования показывают целесо-образность полной или частичной замены саха-розы на трегалозу в производстве мороженогофункциональной направленности (с низким содержа-нием жира и сахарозы).Критерии авторстваА. В. Ландиховская – обзор литературы, прове-дение и обработка результатов экспериментальныхисследований. А. А. Творогова – постановка инаучное руководство исследованиями. Н. В. Казакова– методология экспериментальных исследований.И. А. Гурский – микроструктурные исследованиякристаллов льда.Конфликт интересовАвторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.БлагодарностиВыражаем благодарность компанииООО «Торгснаб» за предоставленную трегалозудля проведения исследования.ContributionA.V. Landikhovskaya reviewed scientific sources,conducted the experimental studies, and processed theresults. A.A. Tvorogova acted as scientific advisor,defined the research objectives, and stated the problem.N.V. Kazakova developed the experimental researchmethodology. I.A. Gursky performed the microstructuralstudies of ice crystals.</p>
 </body>
 <back>
  <ref-list>
   <ref id="B1">
    <label>1.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Обеспеченность населения России микронутриентами и возможности ее коррекции. Состояние проблемы / В. М. Коденцева, О. А. Вржесинская, Д. В. Рисник [и др.] // Вопросы питания. - 2017. - Т. 86, № 4. - С. 113-124.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Kodentsova VM, Vrzhesinskaya OA, Risnik DV, Nikityuk DB, Tutelyan VA. Micronutrient status of population of the russian federation and possibility of its correction. State of the problem. Problems of Nutrition. 2017;86(4):113-124. (In Russ.).</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B2">
    <label>2.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Сандракова, И. В. Исследование потребителей продуктов здорового питания / И. В. Сандракова, И. Ю. Резниченко // Практический маркетинг. - 2019. - Т. 274, № 12. - С. 22-27.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Sandrakova IV, Reznichenko IYu. Health food consumers research. Practical Marketing. 2019;274(12):22-27.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B3">
    <label>3.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">O’Sullivan, M. G. Reduced-fat products and challenges / M. G. O’Sullivan // Salt, fat and sugar reduction / M. G. O’Sullivan. - Woodhead Publishing, 2020. - P. 63-96. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-819741-7.00003-1.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">O’Sullivan MG. Reduced-fat products and challenges. In: O’Sullivan MG, editor. Salt, fat and sugar reduction. Woodhead Publishing; 2020. pp. 63-96. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-819741-7.00003-1.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B4">
    <label>4.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Совершенствование композиционного состава и структуры молочного мороженого / А. А. Творогова, Т. В. Коновалова, А. В. Ландиховская [и др.] // Техника и технология пищевых производств. - 2018. - Т. 48, № 2. - С. 109-116. DOI: https://doi.org/10.21603/2074-9414-2018-2-109-116.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Tvorogova AA, Shobanova TV, Landikhovskaya AV, Zakirova RR. Milk ice cream composition and structure improvement. Food Processing: Techniques and Technology. 2018;48(2):109-116. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.21603/2074-9414-2018-2-109-116.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B5">
    <label>5.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Ice cream: uses and method of manufacture / S. S. Deosarkar, C. D. Khedkar, S. D. Kalyankar [et al.] // Encyclopedia of food and health / B. Caballero, P. M. Finglas, F. Toldra. - Academic Press, 2016. - P. 391-397. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-384947-2.00384-6.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Deosarkar SS, Khedkar CD, Kalyankar SD, Sarode AR. Ice cream: uses and method of manufacture. In: Caballero B, Finglas PM, Toldra F, editors. Encyclopedia of food and health. Academic Press; 2016. pp. 391-397. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-384947-2.00384-6.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B6">
    <label>6.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Hartel, R. W. A 100-Year Review: Milestones in the development of frozen desserts / R. W. Hartel, S. A. Rankin, R. L. Bradley // Journal of Dairy Science. - 2017. - Vol. 100, № 12. - P. 10014-10025. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2017-13278.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Hartel RW, Rankin SA, Bradley RL. A 100-Year Review: Milestones in the development of frozen desserts. Journal of Dairy Science. 2017;100(12):10014-10025. DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2017-13278.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B7">
    <label>7.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Olsson, C. Structural comparison between sucrose and trehalose in aqueous solution / C. Olsson, J. Swenson // Journal of Physical Chemistry B. - 2020. - Vol. 124, № 15. - P. 3074-3082. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.9b09701.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Olsson C, Swenson J. Structural comparison between sucrose and trehalose in aqueous solution. Journal of Physical Chemistry B. 2020;124(15):3074-3082. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.9b09701.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B8">
    <label>8.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Ohtake, S. Trehalose: current use and future applications / S. Ohtake, Y. J. Wang // Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2011. - Vol. 100, № 6. - P. 2020-2053. DOI: https://doi.org/10.1002/jps.22458.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Ohtake S, Wang YJ. Trehalose: current use and future applications. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2011;100(6):2020-2053. DOI: https://doi.org/10.1002/jps.22458.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B9">
    <label>9.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Water mobility in the dehydration of crystalline trehalose / F. Sussich, C. E. Skopec, J. W. Brady [et al.] // Food Chemistry. - 2010. - Vol. 122, № 2. - P. 388-393. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.08.014.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Sussich F, Skopec CE, Brady JW, Cesàro A. Water mobility in the dehydration of crystalline trehalose. Food Chemistry. 2010;122(2):388-393. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2009.08.014.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B10">
    <label>10.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Soukoulis, C. Contribution of thermal, rheological and physical measurements to the determination of sensorially perceived quality of ice cream containing bulk sweeteners / C. Soukoulis, E. Rontogianni, C. Tzia // Journal of Food Engineering. - 2010. - Vol. 100, № 4. - P. 634-641. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2010.05.012.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Soukoulis C, Rontogianni E, Tzia C. Contribution of thermal, rheological and physical measurements to the determination of sensorially perceived quality of ice cream containing bulk sweeteners. Journal of Food Engineering. 2010;100(4):634-641. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2010.05.012.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B11">
    <label>11.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Lammert, A. M. Water activity and solubility of trehalose / A. M. Lammert, S. J. Schmidt, G. A. Day // Food Chemistry. - 1998. - Vol. 61, № 1-2. - P. 139-144. DOI: https://doi.org/10.1016/S0308-8146(97)00132-5.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Lammert AM, Schmidt SJ, Day GA. Water activity and solubility of trehalose. Food Chemistry. 1998;61(1-2):139-144. DOI: https://doi.org/10.1016/S0308-8146(97)00132-5.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B12">
    <label>12.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Liu, J. Protective mechanisms of α,α-trehalose revealed by molecular dynamics simulations / J. Liu, C. Chen, W. Li // Molecular Simulation. - 2017. - Vol. 44, № 2. - P. 100-109 DOI:  https://doi.org/10.1080/08927022.2017.1342126.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Liu J, Chen C, Li W. Protective mechanisms of α,α-trehalose revealed by molecular dynamics simulations. Molecular Simulation. 2017;44(2):100-109 DOI: https://doi.org/10.1080/08927022.2017.1342126.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B13">
    <label>13.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Effect of trehalose on the glass transition and ice crystal growth in ice cream / A. P. Whelan, A. Regand, C. Vega [et al.] // International Journal of Food Science and Technology. - 2008. - Vol. 43, № 3. - P. 510-516. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.2006.01484.x.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Whelan AP, Regand A, Vega C, Kerry JP, Goff HD. Effect of trehalose on the glass transition and ice crystal growth in ice cream. International Journal of Food Science and Technology. 2008;43(3):510-516. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.2006.01484.x.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B14">
    <label>14.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Walmagh, M. Trehalose analogues: Latest insights in properties and biocatalytic production / M. Walmagh, R. Zhao, T. Desmet // International Journal of Molecular Sciences. - 2015. - Vol. 16, № 6. - P. 13729-13745. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms160613729.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Walmagh M, Zhao R, Desmet T. Trehalose analogues: Latest insights in properties and biocatalytic production. International Journal of Molecular Sciences. 2015;16(6):13729-13745. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms160613729.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B15">
    <label>15.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Кудряшов, Л. С. Применение фосфатов и трегалозы при производстве колбас из PSE свинины / Л. С. Кудряшов, О. А. Кудряшова // Индустрия питания. - 2017. - Т. 2, № 1. - С. 38-44.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Kudryashov LS, Kudryashova OA. The phosphate and trehalose use in the sausages production from PSE pork. Food Industry. 2017;2(1):38-44. (In Russ.).</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B16">
    <label>16.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Trehalose as a cryoprotectant in freeze-dried wheat sourdough production / R. F. Stefanello, A. A. R. Machado, C. Pasqualin Cavalheiro [et al.] // LWT - Food Science and Technology. - 2018. - Vol. 89. - P. 510-517. DOI: https://doi.org/10.1016/j.lwt.2017.11.011.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Stefanello RF, Machado AAR, Pasqualin Cavalheiro C, Bartholomei Santos ML, Nabeshima EH, Copetti MV, et al. Trehalose as a cryoprotectant in freeze-dried wheat sourdough production. LWT - Food Science and Technology. 2018;89:510-517. DOI: https://doi.org/10.1016/j.lwt.2017.11.011.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B17">
    <label>17.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Insights into ice-growth inhibition by trehalose and alginate oligosaccharides in peeled Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) during frozen storage / B. Zhang, H.-J. Cao, H.-M. Lin [et el.] // Food Chemistry. - 2019. - Vol. 278. - P. 482-490. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.11.087.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Zhang B, Cao H-J, Lin H-M, Deng S-G, Wu H. Insights into ice-growth inhibition by trehalose and alginate oligosaccharides in peeled Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) during frozen storage. Food Chemistry. 2019;278:482-490. DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.11.087.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B18">
    <label>18.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Goff, H. D. The structure and properties of ice cream and frozen desserts / H. D. Goff // Encyclopedia of food chemistry / L. Melton, F. Shahidi, P. Varelis. - Elsevier, 2019. - P. 47-54. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-08-100596-5.21703-4.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Goff HD. The structure and properties of ice cream and frozen desserts. In: Melton L, Shahidi F, Varelis P, editors. Encyclopedia of food chemistry. Elsevier; 2019. pp. 47-54. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-08-100596-5.21703-4.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
   <ref id="B19">
    <label>19.</label>
    <citation-alternatives>
     <mixed-citation xml:lang="ru">Sitnikova, P. B. Physical changes in the structure of ice cream and frozen fruit desserts during storage / P. B. Sitnikova, A. A. Tvorogova // Food Systems. - 2019. - Vol. 2, № 2. - P. 31-35. DOI: https://doi.org/10.21323/2618-9771-2019-2-2-31-35.</mixed-citation>
     <mixed-citation xml:lang="en">Sitnikova PB, Tvorogova AA. Physical changes in the structure of ice cream and frozen fruit desserts during storage. Food Systems. 2019;2(2):31-35. DOI: https://doi.org/10.21323/2618-9771-2019-2-2-31-35.</mixed-citation>
    </citation-alternatives>
   </ref>
  </ref-list>
 </back>
</article>
