Введение В последние годы концепция оздоровления человека и предупреждения старения организма путем включения в рацион кисломолочных продуктов развивается в направлении определения звеньев механизма, которые в целом характеризуются как пробиотическое воздействие [1, 2].Взаимосвязь макроорганизма и его микрофлоры очень велика. Нормальная микрофлора влияет на структуру слизистой оболочки кишечника и ее адсорбционную способность, участвует в обмене жирных кислот, метаболизме липидов, желчных кислот, билирубина, водно-солевом и газообмене. Микроорганизмы желудочно-кишечного тракта совершают ряд ферментативных реакций, синтезируют витамин К, витамины группы В, никотиновую, фолиевую и пантотеновую кислоты [3, 4].   Недостаток представителей здоровой микрофлоры вызывает ослабление как клеточных, так и гуморальных факторов иммунологической защиты. Нормальная микрофлора благодаря выраженной антагонистической ак­тивности предохраняет организм от внедрения патогенной флоры. Дисбаланс микробной экологии человека приводит к тяжелым заболеваниям как желудочно-кишечного тракта, так и организма в целом. В связи с этим актуальной является разработка продуктов, обладающих про­биотическими свойствами.     В настоящее время достаточно фактических данных, свидетельствующих о наличии пробиотических свойств у пропионовокислых бактерий.Пропионовокислые бактерии не перевариваются в желудочно-кишечном тракте людей, устойчивы к действию желчных кислот и выдерживают низкую (рН 2.0) кислотность желудка. Они ингибируют активность р-глюкуронидазы, азаредуктазы и нитроредуктазы – ферментов, образуемых кишечной микрофлорой и вовлекаемых в образование мутагенов, канцерогенов и промоторов роста опухолей [5].Классические пропионовокислые бактерии образуют ряд белковых бактериоцинов. Штаммы Propionibacterium thoenii и Propionibacterium jensenii образуют термоустойчивые белки, ингибирующие ряд грамотрицательных и грамположительных бактерий, дрожжей и плесеней [6, 7].Экспериментальные и клинические испытания пропионовых бактерий показали иммуномодули-рующую, ан­тивирусную активность в клинических исследованиях, что связывают с активацией моноцитмакрофаговой сис­темы, индукцией синтеза интерферона и активацией киллерных клеток [6, 8].Пагубное действие на организмы радиационных излучений и химических мутагенов связано с возникновением свободных радикалов. Потенциальными биологическими мишенями для радикальной атаки служат липиды, белки, нуклеиновые кислоты. Свободные радикалы часто вовлекаются в активацию многих типов прокарциногенов и промутагенов, превращая их в карциногены и мутагены и связывая эти активированные формы с ДНК. Пропионовокислые бактерии служат источником ряда веществ, предотвращающих данные негативные реакции в организме [9].В ряде исследований показана высокая антимутагенная активность пропионовокислых бактерий, которая коррелирует с накоплением в среде тиоловых соединений. Максимальная антимутагенная активность соответствует максимальной аккумуляции в среде тиолов. Антимутагенная защита пропионовых бактерий не только способствует сохранению собственного генотипа, но и может быть использована для стабилизации генотипов и микробных ферментаций других организмов.Исследования последних лет показывают, что в пробах содержимого кишечника долгожителей наряду с дрожжевой микрофлорой определяется наличие и видовой состав молочнокислых бактерий. Оказалось, что повышение содержания в кишечнике долгожителей коррелирует с высоким количеством молочнокислых бактерий [10].Антагонизм молочнокислых бактерий обусловлен способностью образовывать специфические антибиотические вещества: S. Lactis – низина, S. Cremoris – диплококкцина, L. Acidohilus – ацидофилина и лактоцидина, L. Plantarum – лактолина, L. Brevis –               бревина и др.Антибиотики, являясь специфическими продуктами жизнедеятельности микроорганизмов, обладают высокой физиологической активностью по отношению к определенным патогенным группам, вирусам или злокачественным опухолям, задерживая их рост или полностью подавляя их развитие.Установленная в последние годы способность молочнокислых бактерий стимулировать образование интерферона и выводить радионуклеиды позволяет говорить о необходимости получения высокопродуктивных штаммов, обладающих биосинтетическими свойствами, особенно физиологической активностью и антагонизмом, положительно влияющих на состояние здоровья человека и играющих важную роль в создании фермента долголетия [11].При разработке продуктов нового поколения предлагается использовать микроорганизмы, способные оказывать положительное влияние на иммунную систему человека. В связи с этим большой интерес представляет применение таких эффективных иммуностимулирующих средств, как кефир.     Высокая питательная ценность кефира объясняется главным образом тем, что в нем белки молока находятся в более усвояемой форме, чем в натуральном молоке. Пептонизация белков молока в процессе сквашивания вызывается молочной кислотой, образующейся в кефире, и ферментами, выделяемыми молочнокислыми бактериями, и отчасти дрожжами. По мере протекания молочнокислого и спиртового брожения количество продуктов распада белков увеличивается [12]. Наличие молочнокислых бактерий и дрожжей с их способностью синтезировать антибиотики и витамины дополняет высоколечебное и диетическое значение кефира [11]. Особенно часто кефир применяется при хронических расстройствах пищеварительной деятельности под влиянием различных заболеваний желудочно-кишечного тракта: стимулирует выделение пищеварительных соков, нормализует моторную функцию пищеварительного тракта, возбуждает аппетит. Нередко люди, страдающие аллергией к молоку, хорошо переносят кефир [13].Целью данной работы является создание консорциума микроорганизмов кефирной грибковой закваски и пропионовокислых бактерий и изучение пробиотических свойств полученной комбинированной закваски. Сочетание микрофлоры кефирной грибковой закваски и пропионовокислых бактерий позволит повысить пробиотические свойства кисломолочных продуктов.  Объекты и методы исследований Экспериментальные исследования проводились на кафедре «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» проблемной научно-исследовательской лаборатории Восточно-Сибирского государственного университета технологий и управления.Объектами исследований служили штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacterium freuden-reichii subsp. Shermanii КМ 186, Propionibacterium freudenreichii subsp. Freudenreichii АС-2500, Pro-pionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii АС-2503 и кефирная грибковая закваска. Штаммы пропионовокислых бактерий получены из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов Институтабиохимии и физиологии микроорганизмов (Москва), активизированы биотехнологическим способом, разработанным в Восточно-Сибирском государствен-ном технологическом университете. Основные физико-химические и микробиологи-ческие показатели сырья, заквасок и кисломолочных продуктов определяли стандартными и общеприня-тыми в исследовательской практике методами.Антимутагенную активность определяли по тесту Эймса, антибиотическую активность – методом последовательных разведений по М.С. Полонскому. Количество витамина В6 определяли микробиологи-ческим методом. Выделение витамина В6 в свободной форме достигается автоклавированием образца с растворами серной и соляной кислот различной концентрации при различном давлении и продол-жительности обработки. Для этой цели применяют также папаин, такадиастазу, кларазу [14], фермент-ный препарат из гриба Aspergillus oryzae [15]. Результаты и их обсуждениеРост и метаболическая активность бактерий служат фундаментальными факторами для полу-чения биомассы и промышленно ценных продуктов. К этим факторам следует добавить еще одно важное свойство бактерий – биосинтез соединений, обла-дающих антимутагенным и антиканцерогенным действием. Под антимутагенезом понимают снижение частоты спонтанной и индуцированной мутации. Анти-мутагены регулируют скорость спонтанных мутаций, стабилизируют мутационный процесс [9, 16].  В целом проблема антимутагенеза и анти-мутагенных свойств бактерий имеет большое бу-дущее, ибо включает в себя как вопросы здоровья людей, так и фундаментальные вопросы биологии.Изучение антимутагенеза важно именно в отно-шении тех бактерий, которые используют при изготовлении пищевых продуктов. Бактерии-пробио-тики как источники антибиомутагенов или десмута-генов могут быть использованы для предобработки пищевых продуктов с целью нейтрализации мута-генных (канцерогенных) веществ. Пропионовокислые бактерии известны выраженным антимутагенным действием. Поскольку в естественных условиях микроорганизмы постоянно подвергаются действию мутагенов, у них сформировался эндогенный и экзогенный защитные механизмы: у всех живых существ образуются молекулы, способные к осуществлению антимутагенеза. Антимутагены пропионовокислых бактерий повышают активность ферментных систем, участвующих в детоксикации поступающих в клетку веществ, оказывая влияние на окислительно-восстановительный потенциал организма, эти процессы приводят к снижению мутаций [17]. Однако антимутагенез кефирных грибков до сих пор не изучен. В связи с этим была исследована антимутагенная активность комбинированной закваски. Результаты исследований представлены в табл. 1.       Таблица 1 Определение антимутагенной активности комбинированной закваски Видмикро-организмовВремякультивирования, чСреднее число ревертантов на чашкуИнгибирование, %Кефирнаягрибковая закваска4888530,0Пропионовокислые бактерии Pr. Shermanii КМ 1864850247,2Комбинированная закваска4853257,8 В результате экспериментальных исследований установлено, что кефирная грибковая закваска обладает достаточно высокой антимутагенной активностью в отношении мутагенеза, индуцируемого            4-нитрохинолин-N-оксидом. Следует отметить, что степень ингибирования на 17 % ниже, чем у пропионовокислых бактерий. Наиболее сильное ингибирующее действие обнаружено у комбинированной закваски. Вероятно, более высокая антимутагенная активность комбинированной закваски объясняется тем, что микроорганизмы закваски синтезируют значительные количества антиокислительных ферментов: супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы. Одновременное присутствие этих ферментов позволяет клетке удалять супероксидные и пероксидные радикалы, образованные в окислительных реакциях [18].Таким образом, установлено, что кефирная грибковая закваска обладает выраженной антимутагенной активностью. Кроме того, введение пропионовокислых бактерий в консорциум микроорганизмов кефирной грибковой закваски повышает антимутагенные свойства комбинированной закваски.Биологические свойства молока и молочных продуктов в значительной степени обусловливаются специфическим действием молочнокислых бактерий, которое проявляется в характере взаимоотношений между ними и в антагонистическом влиянии на постороннюю микрофлору [19].  Результаты исследований ряда авторов [20, 21] показывают, что антагонистическая активность является не только видовым, но и специфическим штаммовым признаком. В связи с этим особого внимания заслуживают исследования, направленные на изучение антибиотической активности закваски. Полученные данные сведены в табл. 2.Как видно из данных табл. 2, при раздельном культивировании компонентов комбинированной закваски наиболее выраженной антибиотической активностью по отношению к E. Coli I53 и S. Sonnei 2848 обладает кефирная грибковая закваска, несколько меньшей – пропионовокислые бактерии.  Таблица 2 Антибиотическая активность заквасок Вид закваскиРост бактерий в разведенияхE. coli I53S. sonnei 2848Отсутст-вие ростаТормож-ение ростаОтсутс-твие ростаТормож-ение ростаПропионовокислые бактерии Pr. Shermanii КМ 1861:41:161:81:32Кефирная грибковая закваска1:41:321:41:64Комбинированная закваска1:81:641:161:128 Важно подчеркнуть высокую антибиотическую активность комбинированной закваски в сравнении с отдельными культурами. Бактерицидное действие комбинированной закваски по отношению к E. Coli проявлялось в разведении 1:8, а к S. Sonnei 1:16. Бактериостатическое действие закваски по отноше-нию к этим культурам отмечено в разведениях 1:16 и 1:128 соответственно. Таким образом, установлено, что комбини-рованная закваска обладает выраженной антибио-тической активностью по отношению к патогенной микрофлоре.    Изучение пробиотических свойств комбинированной закваски наряду с другими показателями предусматривает получение данных о содержании в ней витаминов.Молоко является хорошим источником витаминов. Известно, что содержание витаминов может значительно изменяться в процессе технологической обработки и при хранении пищевых продуктов. В связи с этим практическое решение основных проблем в области получения высококачественных продуктов питания невозможно без осуществления контроля за качественным и количественным содержанием в них витаминов.Из всех технологических операций при производстве молочных продуктов на изменение содержания витаминов наибольшее влияние оказывает термическая обработка. По мнению ряда исследователей, тепловая обработка приводит к уменьшению большинства витаминов (и тем в большей степени, чем выше температура и продолжительность выдержки). Однако последующая ферментация молока может привести к увеличению содержания витаминов [22, 23].   Нами изучено изменение тиамина, рибофлавина и витамина В6 в процессе производства кефирного продукта. Поскольку при производстве кефирного продукта используется комбинированная закваска, проводили сравнительные исследования содержания витаминов при сквашивании молока кефирной грибковой закваской и комбинированной закваской. Результаты представлены в табл. 3. Таблица 3 Содержание витаминов в молочных продуктах МолокоКоличество витаминов, мкг/кгТиамин(витамин В1)Рибофлавин(витамин В2)Пиридоксин(витамин В6)Молоко пастеризованное 317±0,411358±0,25263±0,32Молоко,сквашенное кефирными грибками375±0,151741±0,11315±0,17Молоко, сквашенное пропионовокислыми бактериями391±0,321795±0,19332±0,12Молоко, сквашенное комбинированной закваской420±0,521835±0,27367±0,25В ходе исследований установлено, что в готовом продукте, выработанном как с использованием кефирной грибковой закваски, так и с использованием комбинированной закваски, содержание тиамина, рибофлавина и витамина В6 возрастает. Результаты исследований, представленные в табл. 3, показывают, что в результате введения пропионовокислых бактерий в кефирную грибковую закваску в кефирном продукте увеличивается содержание витаминов группы В. Выводы В результате проведенных исследований установлено, что введение пропионовокислых бактерий в состав консорциума кефирной грибковой закваски повышает пробиотические свойства комбинированной закваски. Выявлено, что консорциум микроорганизмов пропионовокислых бактерий и кефирной грибковой закваски обладает выраженной антимутагенной активностью.Разработанная ассоциация микроорганизмов отличается высокой антибиотической и витамин-образующей активностью.